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xiaoheimai

新虫 (初入文坛)

做菌液PCR时目的片段不要太大,如果太大的话很容易出问题,2000bp以下的片段可信度还是可以的,再大的话可以考虑用菌液电泳的方法来检测,然后酶切验证
11楼2012-09-21 11:41:32
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sd3824289

木虫 (正式写手)

楼主,我有个建议,在你做阳性筛选的时候,将挑选出来的克隆,提取质粒,并且用双酶切进行鉴定!这样很保险!如果酶切结束后有条带,就送去测序,如果没有的话,那么就请继续前面的工作吧!祝好运!
坚持,就像流星,即使知道最后的结果,也要勇敢的走到最后!
12楼2012-09-22 10:29:11
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

菌落PCR+双酶切
在不保险的话,单酶切都做下
跑胶的时候,把各种对照都带上,比如带上质粒双酶切的,带上插入片段的,在带上你单酶切的,双酶切的,就全了
菌落PCR假阳性很高。。。不是很可靠
觉得酶切验证没问题了,送去测个序,做个blast
13楼2012-09-22 17:01:10
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黑色de星期⑧

金虫 (初入文坛)

你设计载体的时候加点抗性位点啊,这样就又多了一个筛选标准!1我们实验室的转化基本上都有抗生素抗性或者荧光物质
14楼2012-09-22 19:46:49
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-09-22 17:01:10
菌落PCR+双酶切
在不保险的话,单酶切都做下
跑胶的时候,把各种对照都带上,比如带上质粒双酶切的,带上插入片段的,在带上你单酶切的,双酶切的,就全了
菌落PCR假阳性很高。。。不是很可靠
觉得酶切验证没问 ...

我先做了菌落pcr,后提了质粒,用提出来的质粒作模板进行pcr,同时又做了双酶切,跑胶的时候目的片段都出来了,然后送去测序,结果还没出来,但是我看到测序进展中说是样本浓度低,这是不是意味着又测不出来了呢?
15楼2012-09-23 19:35:55
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by 黑色de星期⑧ at 2012-09-22 19:46:49
你设计载体的时候加点抗性位点啊,这样就又多了一个筛选标准!1我们实验室的转化基本上都有抗生素抗性或者荧光物质

pET-28a本来就有抗性的,筛选的培养基都是含抗生素。。。
16楼2012-09-23 19:37:13
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