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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 阳性克隆的筛选问题
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xiaoheimai

新虫 (初入文坛)
做菌液PCR时目的片段不要太大，如果太大的话很容易出问题，2000bp以下的片段可信度还是可以的，再大的话可以考虑用菌液电泳的方法来检测，然后酶切验证
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11楼2012-09-21 11:41:32
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sd3824289

木虫 (正式写手)
楼主，我有个建议，在你做阳性筛选的时候，将挑选出来的克隆，提取质粒，并且用双酶切进行鉴定！这样很保险！如果酶切结束后有条带，就送去测序，如果没有的话，那么就请继续前面的工作吧！祝好运！
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坚持，就像流星，即使知道最后的结果，也要勇敢的走到最后！
12楼2012-09-22 10:29:11
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mamadexiao

木虫 (正式写手)
菌落PCR+双酶切
在不保险的话，单酶切都做下
跑胶的时候，把各种对照都带上，比如带上质粒双酶切的，带上插入片段的，在带上你单酶切的，双酶切的，就全了
菌落PCR假阳性很高。。。不是很可靠
觉得酶切验证没问题了，送去测个序，做个blast
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13楼2012-09-22 17:01:10
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黑色de星期⑧

金虫 (初入文坛)
你设计载体的时候加点抗性位点啊，这样就又多了一个筛选标准！1我们实验室的转化基本上都有抗生素抗性或者荧光物质
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14楼2012-09-22 19:46:49
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-09-22 17:01:10
菌落PCR+双酶切
在不保险的话，单酶切都做下
跑胶的时候，把各种对照都带上，比如带上质粒双酶切的，带上插入片段的，在带上你单酶切的，双酶切的，就全了
菌落PCR假阳性很高。。。不是很可靠
觉得酶切验证没问 ...

我先做了菌落pcr，后提了质粒，用提出来的质粒作模板进行pcr，同时又做了双酶切，跑胶的时候目的片段都出来了，然后送去测序，结果还没出来，但是我看到测序进展中说是样本浓度低，这是不是意味着又测不出来了呢？
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15楼2012-09-23 19:35:55
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 黑色de星期⑧ at 2012-09-22 19:46:49
你设计载体的时候加点抗性位点啊，这样就又多了一个筛选标准！1我们实验室的转化基本上都有抗生素抗性或者荧光物质

pET-28a本来就有抗性的，筛选的培养基都是含抗生素。。。
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16楼2012-09-23 19:37:13
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