应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 阳性克隆的筛选问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
161/2返回列表12下一页
查看: 2442  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 阳性克隆的筛选问题

请教各位虫友，最近我在做连接，在转化之后挑取平板上的单菌落进行菌落pcr，结果显示为阳性的克隆却在双酶切的时候没有目的片段，而且测序也没有信号。请问这是怎么回事呢？用什么方法检验阳性克隆比较科学呢？（注：菌落pcr时阴阳性对照都设置了，阴性没P出来，阳性P出来的条带比菌落亮）

[ Last edited by xuyan_1215 on 2012-9-19 at 17:15 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-09-19 17:11:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
菌液PCR快速，简单，通量大，但是有假阳性率，一般就是菌液PCR后，酶切鉴定，然后测序，如果经费充足，或者节省时间的话，就是菌液PCR，然后直接测序。一般测序结果是判断标准
赞一下 回复此楼
2楼2012-09-19 18:17:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-19 18:17:10
菌液PCR快速，简单，通量大，但是有假阳性率，一般就是菌液PCR后，酶切鉴定，然后测序，如果经费充足，或者节省时间的话，就是菌液PCR，然后直接测序。一般测序结果是判断标准

我也是这样做的，每次做完菌液pcr就送样测序，但是结果总是无信号，这假阳性的概率也太大了。。。
赞一下 回复此楼
3楼2012-09-20 07:09:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-09-20 14:41:19
菌落PCR只能初步的判断下是否连接转化成功，但是假阳性率是非常高的，原因是因为裂解液残留的问题，你可以把你挑的几个阳性克隆进行扩大培养，然后提取质粒做质粒PCR和质粒酶切，这样就能确保没问题。
赞一下 回复此楼
生物化学与分子生物学
4楼2012-09-20 08:03:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-20 08:03:45
菌落PCR只能初步的判断下是否连接转化成功，但是假阳性率是非常高的，原因是因为裂解液残留的问题，你可以把你挑的几个阳性克隆进行扩大培养，然后提取质粒做质粒PCR和质粒酶切，这样就能确保没问题。

这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？
赞一下 回复此楼
5楼2012-09-20 09:51:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+3 2012-09-20 14:41:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？...

工作量相当大？
一般转化后要结合几个方面确认后再送出测序：
菌落PCR：可以使用目的片段引物，载体引物，以及2者搭配鉴定。
选阳性克隆培养提质粒，PCR再鉴定。
酶切鉴定。
以上都正确才会送出测序。这些过程都可以在1天内完成，算不上工作量大吧。直接送出测序不仅浪费时间，如果错了回来还得重来，得不偿失。
赞一下 回复此楼
6楼2012-09-20 10:20:31
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
xuyan_1215: 金币+2, ★有帮助 2012-09-20 14:41:45
引用回帖:
3楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 07:09:31
我也是这样做的，每次做完菌液pcr就送样测序，但是结果总是无信号，这假阳性的概率也太大了。。。...

那你得调整下连接，转化体系了。
赞一下 回复此楼
7楼2012-09-20 12:40:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过，但是我一般挑16个菌落进行pcr，每次都能出现10个以上的阳性克隆，那要是逐个挑取提质粒，工作量相当大呀，你一般是怎么做的？...

嗯 你要是觉得工作量大的话 就可以从你的菌落PCR阳性结果中，选取3到4个条带特别亮的菌落来进行扩大培养和进一步的鉴定！
赞一下 回复此楼
生物化学与分子生物学
8楼2012-09-20 17:13:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by lidonghong at 2012-09-20 17:13:44
嗯 你要是觉得工作量大的话 就可以从你的菌落PCR阳性结果中，选取3到4个条带特别亮的菌落来进行扩大培养和进一步的鉴定！...

嗯，好的，不妨这样做做看。。。谢谢！！
赞一下 回复此楼
9楼2012-09-20 18:45:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lidonghong

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 18:45:43
嗯，好的，不妨这样做做看。。。谢谢！！...

不用谢！客气
回复此楼
生物化学与分子生物学
10楼2012-09-21 10:03:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xuyan_1215 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂 +6 akdhjs 2026-03-31 7/350 2026-03-31 14:39 by yaochuang
[考研] 317求调剂 +11 蛋黄咸肉粽 2026-03-26 12/600 2026-03-31 13:30 by 记事本2026
[考研] 085600 295分求调剂 +13 W55j 2026-03-30 15/750 2026-03-31 13:29 by 王亮_大连医科大
[考研] 286求调剂 +5 丢掉懒惰 2026-03-27 8/400 2026-03-31 11:27 by Delta2012
[考研] 085601一志愿西北工业大学初试346 +4 085601初试346 2026-03-30 4/200 2026-03-31 07:47 by jp9609
[考研] 一志愿食品科学与工程083200求调剂 +4 XQTJZ 2026-03-30 4/200 2026-03-31 04:10 by fmesaito
[考研] 303求调剂 +7 DLkz1314. 2026-03-30 7/350 2026-03-30 21:07 by peike
[考研] 277跪求调剂 +8 1915668 2026-03-27 12/600 2026-03-30 21:01 by dophin1985
[考研] 一志愿厦门大学材料工程专硕354找调剂！！！ +5 贝呗钡钡 2026-03-30 5/250 2026-03-30 18:16 by 无际的草原
[考研] 求调剂323材料与化工 +10 1124361 2026-03-24 10/500 2026-03-30 16:26 by 690616278
[考研] 085404求调剂，总分309，本科经历较为丰富 +6 来财aa 2026-03-25 6/300 2026-03-30 09:48 by 青海小西牛
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856 | GPA 4.07 | 有科研经历 +8 cccchenso 2026-03-29 8/400 2026-03-29 23:53 by 我是小康
[考研] 一志愿武汉理工，总分321，英一数二，求老师收留。 +11 nnnnnnn5 2026-03-25 11/550 2026-03-29 20:42 by 无际的草原
[考研] 总分293求调剂 +8 加一一九 2026-03-25 11/550 2026-03-29 19:53 by 无际的草原
[考研] 药学105500求调剂 +3 Ssun。。 2026-03-28 3/150 2026-03-28 11:24 by lxf170613
[考研] 081200-314 +3 LILIQQ 2026-03-27 4/200 2026-03-28 09:41 by 保护地球你我做�
[考研] 308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-27 7/350 2026-03-28 07:43 by 热情沙漠
[考研] 292求调剂 +4 求求了收下我吧� 2026-03-26 4/200 2026-03-27 10:37 by zhshch
[考研] 286求调剂 +4 lim0922 2026-03-26 4/200 2026-03-27 10:28 by guoweigw
[考研] 303求调剂 +6 蓝山月 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:47 by 418490947
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭