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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 阳性克隆的筛选问题

请教各位虫友,最近我在做连接,在转化之后挑取平板上的单菌落进行菌落pcr,结果显示为阳性的克隆却在双酶切的时候没有目的片段,而且测序也没有信号。请问这是怎么回事呢?用什么方法检验阳性克隆比较科学呢?(注:菌落pcr时阴阳性对照都设置了,阴性没P出来,阳性P出来的条带比菌落亮)

[ Last edited by xuyan_1215 on 2012-9-19 at 17:15 ]
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+3 2012-09-20 14:41:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过,但是我一般挑16个菌落进行pcr,每次都能出现10个以上的阳性克隆,那要是逐个挑取提质粒,工作量相当大呀,你一般是怎么做的?...

工作量相当大?
一般转化后要结合几个方面确认后再送出测序:
菌落PCR:可以使用目的片段引物,载体引物,以及2者搭配鉴定。
选阳性克隆培养提质粒,PCR再鉴定。
酶切鉴定。
以上都正确才会送出测序。这些过程都可以在1天内完成,算不上工作量大吧。直接送出测序不仅浪费时间,如果错了回来还得重来,得不偿失。
6楼2012-09-20 10:20:31
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无疆@行者

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
菌液PCR快速,简单,通量大,但是有假阳性率,一般就是菌液PCR后,酶切鉴定,然后测序,如果经费充足,或者节省时间的话,就是菌液PCR,然后直接测序。一般测序结果是判断标准
2楼2012-09-19 18:17:10
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 无疆@行者 at 2012-09-19 18:17:10
菌液PCR快速,简单,通量大,但是有假阳性率,一般就是菌液PCR后,酶切鉴定,然后测序,如果经费充足,或者节省时间的话,就是菌液PCR,然后直接测序。一般测序结果是判断标准

我也是这样做的,每次做完菌液pcr就送样测序,但是结果总是无信号,这假阳性的概率也太大了。。。
3楼2012-09-20 07:09:31
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lidonghong

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
xuyan_1215: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-09-20 14:41:19
菌落PCR只能初步的判断下是否连接转化成功,但是假阳性率是非常高的,原因是因为裂解液残留的问题,你可以把你挑的几个阳性克隆进行扩大培养,然后提取质粒做质粒PCR和质粒酶切,这样就能确保没问题。
生物化学与分子生物学
4楼2012-09-20 08:03:45
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