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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] 阳性克隆的筛选问题

请教各位虫友,最近我在做连接,在转化之后挑取平板上的单菌落进行菌落pcr,结果显示为阳性的克隆却在双酶切的时候没有目的片段,而且测序也没有信号。请问这是怎么回事呢?用什么方法检验阳性克隆比较科学呢?(注:菌落pcr时阴阳性对照都设置了,阴性没P出来,阳性P出来的条带比菌落亮)

[ Last edited by xuyan_1215 on 2012-9-19 at 17:15 ]
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reallpf

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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xuyan_1215: 金币+3 2012-09-20 14:41:36
引用回帖:
5楼: Originally posted by xuyan_1215 at 2012-09-20 09:51:55
这样的思路也想过,但是我一般挑16个菌落进行pcr,每次都能出现10个以上的阳性克隆,那要是逐个挑取提质粒,工作量相当大呀,你一般是怎么做的?...

工作量相当大?
一般转化后要结合几个方面确认后再送出测序:
菌落PCR:可以使用目的片段引物,载体引物,以及2者搭配鉴定。
选阳性克隆培养提质粒,PCR再鉴定。
酶切鉴定。
以上都正确才会送出测序。这些过程都可以在1天内完成,算不上工作量大吧。直接送出测序不仅浪费时间,如果错了回来还得重来,得不偿失。
6楼2012-09-20 10:20:31
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