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请大家帮忙看看我的蛋白电泳图，谢谢大家了 已有2人参与
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这是我的蛋白电泳图，最右边的为marker,目的条带在marker的第二条左右，左边的第二，第三，第四泳道为我的蛋白样品，大家看看我的这个目的条带是不是太细太淡了，这样的条带能做western blot吗？谢谢大家帮忙！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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2楼2012-08-18 11:13:14
mitocam
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8楼2014-02-23 16:13:44
凌波丽
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【答案】应助回帖
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左边的第二，第三，第四泳道的样品带涂带太厉害了，还是改进一下吧。 SDS电泳带弥散和拖尾的原因和改进措施(凌波丽，2013-10-7) 1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。 2.原因二：样品溶解不完全。 对策： （1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。 (2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。 （3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。 如此严重的样品带涂带，我不建议直接WB，WB灵敏度高，一抗、二抗质量好，肯定是有阳性反应，但是阳性反应的对应的蛋白质是什么？可能很难让人信服，即使能够区分开三条带的样品，但是三条带涂带如此，不可能让人接受三条带就是各自的单一样品。 |
9楼2014-07-10 23:26:47
凌波丽
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【答案】应助回帖
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如此严重的样品带涂带，我不建议直接WB，WB灵敏度高，一抗、二抗质量好，肯定是有阳性反应，但是阳性反应的对应的蛋白质是什么？可能很难让人信服，即使能够区分开三条带的样品，但是三条带涂带如此，不可能让人接受三条带就是各自的单一样品。当然，有人说：WB不是能够检测出单一蛋白质吗？这样不是反方向证明了弥散的带也是一种蛋白质样品吗？！ 首先，任何免疫反应不可能是完全专一的，多克隆抗体不用说了，即使是单克隆抗体也不是完全识别一种抗原，不同的蛋白质可能会出现为同一种多克隆抗体专一性识别的抗原免疫簇。尤其是在转膜时上样量较大或者一抗用量较大时，这是抗原反应性基本原理决定的，不是WB技术所能克服的。其次，把弥散的带直接点转移到膜上，假如其中含有目的蛋白质，而且的确没有单克隆抗体识别非目的蛋白质的情况，最后的二抗的显示的阳性位点也是目的蛋白质的附着位点，但是此时又如何证明SDSPAGE上的带的哪一个位置是目的蛋白质哪？当然有人会反驳我：我们实现用其他方法确定了目的蛋白质不就行了，比如HPLC,MS，亲和层析等。当然可以那样做。但是你又如何确定WB最后的二抗的显示的阳性位点就是目的蛋白质的附着位点，而不是其他的蛋白质哪？因为事先就知道WB结果的这个位点肯定就是目的蛋白质，因为。。。呵呵。。。既然什么都知道，那么还做这个实验干嘛？！而且什么都知道了，SDS PAGE 电泳还如此弥散，那也不好吧？即便是作为教学演示实验也不好吧！ |
10楼2014-07-10 23:39:43
