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酿酒酵母

铜虫 (初入文坛)

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[求助] 请大家帮忙看看我的蛋白电泳图，谢谢大家了已有2人参与

这是我的蛋白电泳图，最右边的为marker,目的条带在marker的第二条左右，左边的第二，第三，第四泳道为我的蛋白样品，大家看看我的这个目的条带是不是太细太淡了，这样的条带能做western blot吗？谢谢大家帮忙！

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1楼 2012-08-18 11:05:33

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凌波丽

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【答案】应助回帖

如此严重的样品带涂带，我不建议直接WB，WB灵敏度高，一抗、二抗质量好，肯定是有阳性反应，但是阳性反应的对应的蛋白质是什么？可能很难让人信服，即使能够区分开三条带的样品，但是三条带涂带如此，不可能让人接受三条带就是各自的单一样品。当然，有人说：WB不是能够检测出单一蛋白质吗？这样不是反方向证明了弥散的带也是一种蛋白质样品吗？！

首先，任何免疫反应不可能是完全专一的，多克隆抗体不用说了，即使是单克隆抗体也不是完全识别一种抗原，不同的蛋白质可能会出现为同一种多克隆抗体专一性识别的抗原免疫簇。尤其是在转膜时上样量较大或者一抗用量较大时，这是抗原反应性基本原理决定的，不是WB技术所能克服的。其次，把弥散的带直接点转移到膜上，假如其中含有目的蛋白质，而且的确没有单克隆抗体识别非目的蛋白质的情况，最后的二抗的显示的阳性位点也是目的蛋白质的附着位点，但是此时又如何证明SDSPAGE上的带的哪一个位置是目的蛋白质哪？当然有人会反驳我：我们实现用其他方法确定了目的蛋白质不就行了，比如HPLC,MS，亲和层析等。当然可以那样做。但是你又如何确定WB最后的二抗的显示的阳性位点就是目的蛋白质的附着位点，而不是其他的蛋白质哪？因为事先就知道WB结果的这个位点肯定就是目的蛋白质，因为。。。呵呵。。。既然什么都知道，那么还做这个实验干嘛？！而且什么都知道了，SDS PAGE 电泳还如此弥散，那也不好吧？即便是作为教学演示实验也不好吧！