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scutphoenix

木虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序结果老是显示空载,这是为什么呢??

一般的TA克隆,挑选白斑,菌落PCR阳性,送测序,结果老是空载,这是为什么呢??谢谢
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xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scutphoenix: 金币+5, 有帮助, 之前有个师姐也这么说过,现在就想赶速度了 2012-08-14 20:54:30
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-15 15:27:49
如果是菌落PCR容易产生假阳性(你原来连接产物粘在菌落上),所以你要先挑菌落传一次,然后取菌液做PCR.这样不会有假阳性.
     如果是连接不上,考虑你的扩增酶是高保真酶,不能产生非特异的PolyA尾巴.
9楼2012-08-14 16:32:28
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普通回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
PCR阳性,有对照吗,影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落,不妨提质粒验证一下再测序。
2楼2012-08-10 23:29:50
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-10 23:29:50
PCR阳性,有对照吗,影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落,不妨提质粒验证一下再测序。

有对照,并且也不是所有的菌落都是阳性的。
因为做的是TA克隆,所以就没提质粒。
有同学也发生类似的现象,换家测序公司居然就解决了,但我想不通是为什么。
当然,我的可能也不是这种情况。
3楼2012-08-11 07:17:56
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

提高金币,等待大家的帮助:)
4楼2012-08-12 21:25:42
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-13 15:05:29
加入连接酶之后,质粒自连了而你的片段未连上去,这就是为什么要多挑单克隆进行菌落PCR的原因啊。楼主,可以在做连接时加大DNA量(浓度高一点的DNA好一点),连接时间长一点,稍微多加一点连接酶等方法来解决连不上的原因,此外是否你的连接片段太长无法连上,如果只是为了测序,可以酶切成几段后再连或者在你的序列中设计引物将序列分成几个CONTIG后分别连接。如果是做表达,可以更换载体。
5楼2012-08-13 08:09:33
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healy13

禁虫 (小有名气)

感谢参与,应助指数 +1
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6楼2012-08-13 09:36:46
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scutphoenix

木虫 (正式写手)

谢谢。
个人认为整个体系还是挺成熟的,片段的扩增(用的takara的LAtaq)、TA克隆(TAKARA的试剂盒)、转化(takara的感受态)。之前也做成功过,但总是会发生转化后菌落pcr很好,拿去测序是空载。一般这样我会重复,从头开始,幸运的时候头一次成功,不幸的时候要重复个两三次,也就有结果了。
但实在想不通
7楼2012-08-13 11:20:53
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

【答案】应助回帖

以前做TA克隆时,送去测序的是菌液,让测序公司自己接菌,再测的。
啊木
8楼2012-08-14 15:55:30
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xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不要浪费时间了,你查出来上面原因,你就毕业了,换掉所有的药品与酶,从新p,连接,注意要加A,再来一次吧。
不骗你的,血的教训呀
10楼2012-08-14 23:17:52
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