应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » TA克隆测序结果老是显示空载，这是为什么呢？？
121/2返回列表12下一页
查看: 4951  |  回复: 11
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

scutphoenix

木虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序结果老是显示空载，这是为什么呢？？

一般的TA克隆，挑选白斑，菌落PCR阳性，送测序，结果老是空载，这是为什么呢？？谢谢
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

宠物狗狗

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-08-10 22:37:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scutphoenix: 金币+5, ★有帮助, 之前有个师姐也这么说过，现在就想赶速度了 2012-08-14 20:54:30
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-15 15:27:49
如果是菌落PCR容易产生假阳性(你原来连接产物粘在菌落上),所以你要先挑菌落传一次,然后取菌液做PCR.这样不会有假阳性.
     如果是连接不上,考虑你的扩增酶是高保真酶,不能产生非特异的PolyA尾巴.
赞一下(1人) 回复此楼
9楼2012-08-14 16:32:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。
赞一下 回复此楼
2楼2012-08-10 23:29:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scutphoenix

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-10 23:29:50
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。

有对照，并且也不是所有的菌落都是阳性的。
因为做的是TA克隆，所以就没提质粒。
有同学也发生类似的现象，换家测序公司居然就解决了，但我想不通是为什么。
当然，我的可能也不是这种情况。
赞一下 回复此楼
3楼2012-08-11 07:17:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scutphoenix

木虫 (正式写手)
提高金币，等待大家的帮助：）
赞一下 回复此楼
4楼2012-08-12 21:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-13 15:05:29
加入连接酶之后，质粒自连了而你的片段未连上去，这就是为什么要多挑单克隆进行菌落PCR的原因啊。楼主，可以在做连接时加大DNA量（浓度高一点的DNA好一点），连接时间长一点，稍微多加一点连接酶等方法来解决连不上的原因，此外是否你的连接片段太长无法连上，如果只是为了测序，可以酶切成几段后再连或者在你的序列中设计引物将序列分成几个CONTIG后分别连接。如果是做表达，可以更换载体。
赞一下 回复此楼
5楼2012-08-13 08:09:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

healy13

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2012-08-13 09:36:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

scutphoenix

木虫 (正式写手)
谢谢。
个人认为整个体系还是挺成熟的，片段的扩增（用的takara的LAtaq）、TA克隆（TAKARA的试剂盒）、转化（takara的感受态）。之前也做成功过，但总是会发生转化后菌落pcr很好，拿去测序是空载。一般这样我会重复，从头开始，幸运的时候头一次成功，不幸的时候要重复个两三次，也就有结果了。
但实在想不通
赞一下 回复此楼
7楼2012-08-13 11:20:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

billtsu

木虫 (正式写手)

木木

【答案】应助回帖

以前做TA克隆时，送去测序的是菌液，让测序公司自己接菌，再测的。
赞一下 回复此楼
啊木
8楼2012-08-14 15:55:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不要浪费时间了，你查出来上面原因，你就毕业了，换掉所有的药品与酶，从新p，连接，注意要加A，再来一次吧。
不骗你的，血的教训呀
赞一下 回复此楼
10楼2012-08-14 23:17:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 scutphoenix 的主题更新
121/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 某top大学教授说“能够在市场中兑现的能力才是真能力”无比同意！ +4 zju2000 2026-09-26 4/200 2026-09-27 23:10 by 大飞鱼鱼鱼
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 20:58 by Equinoxhua
[基金申请] 师弟论文见刊大半年才想起来申请专利，还能抢救一下吗？ +5 13108017953 2026-09-21 5/250 2026-09-27 16:46 by Leogzhya
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 ViqFlLSxHDGt 2026-09-26 3/150 2026-09-27 10:21 by 4IW0sJvtEqX8
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 ViqFlLSxHDGt 2026-09-26 3/150 2026-09-27 10:15 by 4IW0sJvtEqX8
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 ViqFlLSxHDGt 2026-09-26 3/150 2026-09-27 10:03 by 4IW0sJvtEqX8
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 oeyPlfmMUpOC 2026-09-26 3/150 2026-09-27 09:13 by 4IW0sJvtEqX8
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:44 by XgCC8uTcwILl
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:42 by XgCC8uTcwILl
[论文投稿] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 4/200 2026-09-27 06:39 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 GxESXJmptOtQ 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:32 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:08 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 06:05 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 3/150 2026-09-27 05:56 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +5 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:53 by XgCC8uTcwILl
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:50 by XgCC8uTcwILl
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 5/250 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[公派出国] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 vQZoDrrm7mUF 2026-09-25 4/200 2026-09-27 05:44 by XgCC8uTcwILl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 5/250 2026-09-25 11:19 by yhq9807
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 PGTSwSC3F6nQ 2026-09-24 7/350 2026-09-25 11:18 by yhq9807
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭