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scutphoenix

木虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序结果老是显示空载，这是为什么呢？？

一般的TA克隆，挑选白斑，菌落PCR阳性，送测序，结果老是空载，这是为什么呢？？谢谢
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1楼2012-08-10 22:37:50
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scutphoenix

木虫 (正式写手)
提高金币，等待大家的帮助：）
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4楼2012-08-12 21:25:42
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robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。
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2楼2012-08-10 23:29:50
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scutphoenix

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-10 23:29:50
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。

有对照，并且也不是所有的菌落都是阳性的。
因为做的是TA克隆，所以就没提质粒。
有同学也发生类似的现象，换家测序公司居然就解决了，但我想不通是为什么。
当然，我的可能也不是这种情况。
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3楼2012-08-11 07:17:56
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-13 15:05:29
加入连接酶之后，质粒自连了而你的片段未连上去，这就是为什么要多挑单克隆进行菌落PCR的原因啊。楼主，可以在做连接时加大DNA量（浓度高一点的DNA好一点），连接时间长一点，稍微多加一点连接酶等方法来解决连不上的原因，此外是否你的连接片段太长无法连上，如果只是为了测序，可以酶切成几段后再连或者在你的序列中设计引物将序列分成几个CONTIG后分别连接。如果是做表达，可以更换载体。
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5楼2012-08-13 08:09:33
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