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scutphoenix

木虫 (正式写手)

[求助] TA克隆测序结果老是显示空载，这是为什么呢？？

一般的TA克隆，挑选白斑，菌落PCR阳性，送测序，结果老是空载，这是为什么呢？？谢谢
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1楼 2012-08-10 22:37:50
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

xuyihui2001

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
scutphoenix: 金币+5, ★有帮助, 之前有个师姐也这么说过，现在就想赶速度了 2012-08-14 20:54:30
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-08-15 15:27:49
如果是菌落PCR容易产生假阳性(你原来连接产物粘在菌落上),所以你要先挑菌落传一次,然后取菌液做PCR.这样不会有假阳性.
     如果是连接不上,考虑你的扩增酶是高保真酶,不能产生非特异的PolyA尾巴.
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9楼2012-08-14 16:32:28
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普通回帖

robert-RBT

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。
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2楼2012-08-10 23:29:50
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scutphoenix

木虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by robert-RBT at 2012-08-10 23:29:50
PCR阳性，有对照吗，影响PCR结果的因素很多。如果确信是阳性的菌落，不妨提质粒验证一下再测序。

有对照，并且也不是所有的菌落都是阳性的。
因为做的是TA克隆，所以就没提质粒。
有同学也发生类似的现象，换家测序公司居然就解决了，但我想不通是为什么。
当然，我的可能也不是这种情况。
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3楼2012-08-11 07:17:56
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scutphoenix

木虫 (正式写手)
提高金币，等待大家的帮助：）
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4楼2012-08-12 21:25:42
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流经验 2012-08-13 15:05:29
加入连接酶之后，质粒自连了而你的片段未连上去，这就是为什么要多挑单克隆进行菌落PCR的原因啊。楼主，可以在做连接时加大DNA量（浓度高一点的DNA好一点），连接时间长一点，稍微多加一点连接酶等方法来解决连不上的原因，此外是否你的连接片段太长无法连上，如果只是为了测序，可以酶切成几段后再连或者在你的序列中设计引物将序列分成几个CONTIG后分别连接。如果是做表达，可以更换载体。
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5楼2012-08-13 08:09:33
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healy13

禁虫 (小有名气)
感谢参与，应助指数 +1
本帖内容被屏蔽
6楼2012-08-13 09:36:46
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scutphoenix

木虫 (正式写手)
谢谢。
个人认为整个体系还是挺成熟的，片段的扩增（用的takara的LAtaq）、TA克隆（TAKARA的试剂盒）、转化（takara的感受态）。之前也做成功过，但总是会发生转化后菌落pcr很好，拿去测序是空载。一般这样我会重复，从头开始，幸运的时候头一次成功，不幸的时候要重复个两三次，也就有结果了。
但实在想不通
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7楼2012-08-13 11:20:53
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木

【答案】应助回帖

以前做TA克隆时，送去测序的是菌液，让测序公司自己接菌，再测的。
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啊木
8楼2012-08-14 15:55:30
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xiemin217

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不要浪费时间了，你查出来上面原因，你就毕业了，换掉所有的药品与酶，从新p，连接，注意要加A，再来一次吧。
不骗你的，血的教训呀
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10楼2012-08-14 23:17:52
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