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新虫 (小有名气)

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[求助] 使用E.coli复制质粒，提取质粒产量很低

问题如题，使用invitrogen的TOP 10 Chemically Competent cell作为宿主菌复制PCR2.1 载体携带基因的质粒。culture体积是10ml，挑单菌落接种，抗性是Gentamicin，我是在菌液OD达到1.5之后才提取质粒的。质粒提取用的是qiagen的试剂盒，最后使用50ulEB洗脱，但是质粒浓度很低。这是为什么了？

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1楼 2012-07-08 21:59:32

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陈年芬芳

新虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-07-11 13:40:13

你培养体积很大了，但OD不高，培养的时候盖子不要扭太紧，以免影响溶氧。另外提质粒时，一般4mL菌液（过夜培养）足够。buffer 2孵育一定要2min左右，不要超过4min。洗脱时，将Elution buffer加入后，60度温箱2min，15000离心。
我一般4mL菌液，洗脱体积55uL。浓度基本不低于200 ng/uL，最高时可以提到600 ng/uL。