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weining1203新虫 (小有名气)
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胶回收后再次pcr无目的条带，急，望神人指点。。。 已有1人参与
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由于有杂带，将目的带胶回收后，进行二次pcr，将模板稀释100倍和1000倍，还是p不出，退货温度为梯度，求大神指点。。。第二张图片中弥散条带比较长的为没有稀释模板的，左边的为模板稀释1000倍的，稀释100倍的和1000倍的pcr图基本一样，不再上传了。。。两次pcr条件一致。。。图和说明在下面 第一次pcr图，目的带860bp左右，但有杂带  二次pcr图，左边的为模板稀释1000倍的，右边的模板没有稀释 |
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4楼2012-05-14 09:34:30
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| 二次PCR突变较多，做基因克隆的话，不建议二次PCR。稀释100倍，1000倍的话离子浓度应该已经不会有影响了，可能是浓度太低了。建议回收后用ddH2O溶解，取1ul做模板就OK了。 |
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weining12037楼2012-05-14 15:26:45
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| 如果你直接把第一块胶的目的片段回收的话，那应该是量太少了。用40-50微升PCR产物跑胶，再回收。然后可以把多条切下的胶混合，增加产物浓度。因为过柱的胶纯化本身会造成很多损失，所以要把其实的浓度加大。 |
2楼2012-05-13 22:49:11
weining1203
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6楼2012-05-14 09:40:37
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| 你切胶回收是切几个带呀？我们一般是25ulPCR产物全电泳，两个带合一用试剂盒回收溶20~25ul，然后直接电泳都能看到条带的。所以，你的首要问题就是回收有问题，可能回收产物浓度太低。其次，你回收产物的浓度肯定不如原模板的浓度，最好不要再稀释，倒是可以做个不同模板量的梯度PCR |
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8楼2012-05-14 20:46:11
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9楼2012-05-15 10:11:54
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