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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收后再次pcr无目的条带，急，望神人指点。。。
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weining1203

新虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-05-14 09:37:39:
首先，第一次PCR产物，你是回收了哪一条？胶回收了能看到目的条带，第二次做不出来，很有可能这不是你要的条带。要不你就把第一次回收的坐一下连接，转到大肠杆菌去测序吧，我们以前PCR条带很弱的情况都连接测序过 ...

谢谢您的回复，现在也怀疑不是我的目的条带
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11楼2012-05-15 10:15:47
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weining1203

新虫 (小有名气)
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6楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-05-14 09:40:37:
二次pcr扩增不出条带来挺正常的，这与引物的结合效率有关，当然也可能是elution buffer中的离子抑制了pcr反应，建议用无菌水洗脱，还有，最好是优化一下pcr条件，一次多p几管，多回收，避免二次pcr

谢谢回复，我用的自带的洗脱液洗脱的，但已经稀释了很多倍了，离子应该没什么影响了吧，估计不是我的目的条带
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12楼2012-05-15 10:17:12
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weining1203

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7楼: Originally posted by xixiyx at 2012-05-14 15:26:45:
二次PCR突变较多，做基因克隆的话，不建议二次PCR。稀释100倍，1000倍的话离子浓度应该已经不会有影响了，可能是浓度太低了。建议回收后用ddH2O溶解，取1ul做模板就OK了。

谢谢回复
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13楼2012-05-15 10:17:29
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weining1203

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8楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-05-14 20:46:11:
你切胶回收是切几个带呀？我们一般是25ulPCR产物全电泳，两个带合一用试剂盒回收溶20~25ul，然后直接电泳都能看到条带的。所以，你的首要问题就是回收有问题，可能回收产物浓度太低。其次，你回收产物的浓度肯定不 ...

谢谢回复，看着比较亮的带都回收了，胶回收后电泳可以看见微软的条带
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14楼2012-05-15 10:19:20
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lxiong

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-15 13:49:28
用割胶回收PCR产物再PCR，可能P不出条带来的，这个与引物结合效率有关，据说这与限制性内切酶有点像，前面需要一段片段。建议连接载体，再以此为模板PCR，或者用原来的条件多P几管合并跑电泳割胶回收。
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15楼2012-06-15 10:41:41
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nemo88

禁虫 (小有名气)
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16楼2012-06-15 10:55:46
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加油小小帅

禁虫
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17楼2021-02-02 14:34:58
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