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weining1203

新虫 (小有名气)

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5楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-05-14 09:37:39:
首先,第一次PCR产物,你是回收了哪一条?胶回收了能看到目的条带,第二次做不出来,很有可能这不是你要的条带。要不你就把第一次回收的坐一下连接,转到大肠杆菌去测序吧,我们以前PCR条带很弱的情况都连接测序过 ...

谢谢您的回复,现在也怀疑不是我的目的条带
11楼2012-05-15 10:15:47
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weining1203

新虫 (小有名气)

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6楼: Originally posted by hyacinth326 at 2012-05-14 09:40:37:
二次pcr扩增不出条带来挺正常的,这与引物的结合效率有关,当然也可能是elution buffer中的离子抑制了pcr反应,建议用无菌水洗脱,还有,最好是优化一下pcr条件,一次多p几管,多回收,避免二次pcr

谢谢回复,我用的自带的洗脱液洗脱的,但已经稀释了很多倍了,离子应该没什么影响了吧,估计不是我的目的条带
12楼2012-05-15 10:17:12
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
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7楼: Originally posted by xixiyx at 2012-05-14 15:26:45:
二次PCR突变较多,做基因克隆的话,不建议二次PCR。稀释100倍,1000倍的话离子浓度应该已经不会有影响了,可能是浓度太低了。建议回收后用ddH2O溶解,取1ul做模板就OK了。

谢谢回复
13楼2012-05-15 10:17:29
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weining1203

新虫 (小有名气)

送鲜花一朵
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8楼: Originally posted by 牧歌ping at 2012-05-14 20:46:11:
你切胶回收是切几个带呀?我们一般是25ulPCR产物全电泳,两个带合一用试剂盒回收溶20~25ul,然后直接电泳都能看到条带的。所以,你的首要问题就是回收有问题,可能回收产物浓度太低。其次,你回收产物的浓度肯定不 ...

谢谢回复,看着比较亮的带都回收了,胶回收后电泳可以看见微软的条带
14楼2012-05-15 10:19:20
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lxiong

银虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-15 13:49:28
用割胶回收PCR产物再PCR,可能P不出条带来的,这个与引物结合效率有关,据说这与限制性内切酶有点像,前面需要一段片段。建议连接载体,再以此为模板PCR,或者用原来的条件多P几管合并跑电泳割胶回收。
15楼2012-06-15 10:41:41
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nemo88

禁虫 (小有名气)

本帖内容被屏蔽

16楼2012-06-15 10:55:46
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17楼2021-02-02 14:34:58
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