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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 胶回收后再次pcr无目的条带，急，望神人指点。。。
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] 胶回收后再次pcr无目的条带，急，望神人指点。。。 已有1人参与

由于有杂带，将目的带胶回收后，进行二次pcr，将模板稀释100倍和1000倍，还是p不出，退货温度为梯度，求大神指点。。。第二张图片中弥散条带比较长的为没有稀释模板的，左边的为模板稀释1000倍的，稀释100倍的和1000倍的pcr图基本一样，不再上传了。。。两次pcr条件一致。。。图和说明在下面

第一次pcr图，目的带860bp左右，但有杂带



二次pcr图，左边的为模板稀释1000倍的，右边的模板没有稀释
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1楼 2012-05-12 17:17:45
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小白虾

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你在胶回收洗脱时，用的是试剂盒自带的洗脱液吗?假如是的话就P不出来，我一般都是用灭菌的蒸馏水洗脱。
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飞的更高
4楼2012-05-14 09:34:30
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legend0463

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:40:08
如果你直接把第一块胶的目的片段回收的话，那应该是量太少了。用40-50微升PCR产物跑胶，再回收。然后可以把多条切下的胶混合，增加产物浓度。因为过柱的胶纯化本身会造成很多损失，所以要把其实的浓度加大。
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weining1203
2楼2012-05-13 22:49:11
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weining1203

新虫 (小有名气)
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引用回帖:
2楼: Originally posted by legend0463 at 2012-05-13 22:49:11:
如果你直接把第一块胶的目的片段回收的话，那应该是量太少了。用40-50微升PCR产物跑胶，再回收。然后可以把多条切下的胶混合，增加产物浓度。因为过柱的胶纯化本身会造成很多损失，所以要把其实的浓度加大。

谢谢您的回复，胶回收后电泳看了一下回收效果，有一条非常微弱的目的条带。是不是胶回收中的一些试剂抑制了二次pcr啊？还有再请教您一下，胶回收可不可以直接克隆测序，不进行二次pcr？
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3楼2012-05-14 09:28:20
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xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-14 13:40:21
首先，第一次PCR产物，你是回收了哪一条？胶回收了能看到目的条带，第二次做不出来，很有可能这不是你要的条带。要不你就把第一次回收的坐一下连接，转到大肠杆菌去测序吧，我们以前PCR条带很弱的情况都连接测序过，没有问题的，但个人觉得，连纯化的产物也跑不出条带，菌液PCR估计很难吧。PCR产物可以去测序的，但是一般前面一部分不太准，而且浓度和量都有要求的。
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5楼2012-05-14 09:37:39
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