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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切粘性末端连接不上
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建，需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因，产生相同的粘性末端后连接，但就是连接不上，就高手指教！
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1楼 2012-05-04 15:52:13
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

panda73

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:35:39
有几点建议：
1： 你的载体上PstI和SalI位点之间会切下一个可见的片段吗？
2：如果不能，你需要首先进行两者的单酶切（产生线性化载体片段），然后与未酶切的载体（超螺旋DNA)进行比较，以确定每个酶都在你的质粒上酶切正常。
3：如发现某个单切后与未酶切的质粒电泳特性一样，表明此酶的酶切不正常，可能是质粒上没有这个酶或者此酶失活了，需要再设计实验验证是哪一种情况。
4：如果单切效果良好，表明你的质粒和酶都没问题，那就需要关注酶的用量，加的酶量少回导致酶切不完全，那么克隆是假阳性背景就高，酶量过多，容易出现星活性。我建议你用double digestion designer去计算酶切时所需的酶量，还可以推荐buffer，比较实用，在小木虫上可以搜到的。
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6楼2012-05-04 21:32:09
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普通回帖

guishen10

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍，过夜连接试试
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2楼2012-05-04 16:14:53
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guishen10 at 2012-05-04 16:14:53:
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍，过夜连接试试

我已经做过四次了，每次都是过夜连接。前面三次在酶切质粒载体2300时用的是双酶切，没做出来，这一次我用的是单酶切，但是载体回收浓度很低，就是担心啊 ！
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3楼2012-05-04 16:31:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
单酶切难度更哦，尽量用双酶切吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-05-04 16:42:10
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-04 20:53:27
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你目的基因是怎么得来的？是pcr直接切的还是在其他质粒上切下来的？
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未来不是梦
5楼2012-05-04 20:45:13
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honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:35:48
两个建议：1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱，它里有盐，影响连接效率的。
2：不知道2300载体上两个位点隔多远？太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点，再单切前面的那个点，各一个小时足以；酶切后的大载体用去磷酸酶处理一下，防止自连。同时NEB的这两个酶都有HF的，防止星号活性产生。
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天下事有难易乎？为之，则难者亦易矣；不为，则易者亦难矣。
7楼2012-05-05 00:08:45
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mdtdtao

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
换一个酶切体系试试，那个确定酶切体系的网址上，一般会推荐两种酶切体系的。
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喜欢一切美好的东西
8楼2012-05-05 10:09:46
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你 ...

我的目的基因是自己克隆，并且已经测序出来的基因，叫ABR1基因。我先把该基因连接到pMD19-T上，在转化到DH5a中保存菌液。要做酶切的时候直接提取后在酶切。至于连接载体，我用的是Pucc2300质粒载体，用Sal1和Pst1酶切。我用双酶切没连接上，上次用单酶切还是没有连接上。我2300质粒载体的浓度不高，是不是这个的问题？
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9楼2012-05-07 10:29:21
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你 ...

我的目的基因是自己克隆的，连接到pMD19-T载体上，在转化到DH5a中保存菌液，要用的时候直接提取，再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体，前面几次用双酶切，连接不上，上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切，也没有连接上。我的载体浓度很低，这有没有很大的关系。还有，是不是先用Pst1酶切再用Sal1酶切会不会好些。
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10楼2012-05-07 10:34:21
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