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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

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[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建，需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因，产生相同的粘性末端后连接，但就是连接不上，就高手指教！

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1楼2012-05-04 15:52:13

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panda73

金虫 (小有名气)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:35:39

有几点建议：
1：你的载体上PstI和SalI位点之间会切下一个可见的片段吗？
2：如果不能，你需要首先进行两者的单酶切（产生线性化载体片段），然后与未酶切的载体（超螺旋DNA)进行比较，以确定每个酶都在你的质粒上酶切正常。
3：如发现某个单切后与未酶切的质粒电泳特性一样，表明此酶的酶切不正常，可能是质粒上没有这个酶或者此酶失活了，需要再设计实验验证是哪一种情况。
4：如果单切效果良好，表明你的质粒和酶都没问题，那就需要关注酶的用量，加的酶量少回导致酶切不完全，那么克隆是假阳性背景就高，酶量过多，容易出现星活性。我建议你用double digestion designer去计算酶切时所需的酶量，还可以推荐buffer，比较实用，在小木虫上可以搜到的。