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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切粘性末端连接不上
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建，需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因，产生相同的粘性末端后连接，但就是连接不上，就高手指教！
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1楼2012-05-04 15:52:13
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-05-04 20:53:27
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你目的基因是怎么得来的？是pcr直接切的还是在其他质粒上切下来的？
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未来不是梦
5楼2012-05-04 20:45:13
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 14:01:59
引用回帖:
11楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:34:55:
我的目的基因是自己克隆的，连接到pMD19-T载体上，在转化到DH5a中保存菌液，要用的时候直接提取，再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体，前面几次用双酶切，连接不上，上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切，也没有 ...

你载体上PstI和SalI两个酶切位点之间间隔几个bp？如果是相邻的话，双酶切的效率会很低。如果是这样的话，先用酶切效率低的酶去切，然后电泳回收，回收的片段再用另外一个酶去切，酶切时间要长一些。你可以试试看。
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未来不是梦
17楼2012-05-07 10:48:07
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