5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你 ...

6楼: Originally posted by panda73 at 2012-05-04 21:32:09:
有几点建议：
1： 你的载体上PstI和SalI位点之间会切下一个可见的片段吗？
2：如果不能，你需要首先进行两者的单酶切（产生线性化载体片段），然后与未酶切的载体（超螺旋DNA)进行比较，以确定每个酶都在你的质 ...

7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议：1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱，它里有盐，影响连接效率的。
2：不知道2300载体上两个位点隔多远？太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点，再单切前面 ...

7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议：1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱，它里有盐，影响连接效率的。
2：不知道2300载体上两个位点隔多远？太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点，再单切前面 ...

7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议：1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱，它里有盐，影响连接效率的。
2：不知道2300载体上两个位点隔多远？太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点，再单切前面 ...

11楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:34:55:
我的目的基因是自己克隆的，连接到pMD19-T载体上，在转化到DH5a中保存菌液，要用的时候直接提取，再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体，前面几次用双酶切，连接不上，上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切，也没有 ...

15楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:45:41:
我是用EB洗脱的，我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp，是不是太大了不好连接哦。