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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

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5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选?
还有就是你载体有没有突变,或者是目的片段有没有突变,如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上,我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓,主要是片段尽可能多一些。
你 ...

我的目的基因是自己克隆的,连接到pMD19-T载体上,在转化到DH5a中保存菌液,要用的时候直接提取,再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体,前面几次用双酶切,连接不上,上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切,也没有连接上。我的载体浓度很低,这有没有很大的关系。还有,是不是先用Pst1酶切再用Sal1酶切会不会好些。
11楼2012-05-07 10:34:55
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

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6楼: Originally posted by panda73 at 2012-05-04 21:32:09:
有几点建议:
1: 你的载体上PstI和SalI位点之间会切下一个可见的片段吗?
2:如果不能,你需要首先进行两者的单酶切(产生线性化载体片段),然后与未酶切的载体(超螺旋DNA)进行比较,以确定每个酶都在你的质 ...

目的基因酶切后电泳是正常,有1200bp左右。我觉得主要是2300载体酶切效果不怎么好,浓度低。还有会不会是我的2300有问题,我直接拿它电泳,只有一条片段。
12楼2012-05-07 10:40:56
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

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7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议:1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱,它里有盐,影响连接效率的。
2:不知道2300载体上两个位点隔多远?太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点,再单切前面 ...

我是用EB洗脱的,我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp,是不是太大了不好连接哦。
13楼2012-05-07 10:43:10
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议:1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱,它里有盐,影响连接效率的。
2:不知道2300载体上两个位点隔多远?太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点,再单切前面 ...

我是用EB洗脱的,我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp,是不是太大了不好连接哦。
14楼2012-05-07 10:43:48
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by honinglee at 2012-05-05 00:08:45:
两个建议:1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱,它里有盐,影响连接效率的。
2:不知道2300载体上两个位点隔多远?太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点,再单切前面 ...

我是用EB洗脱的,我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp,是不是太大了不好连接哦。
15楼2012-05-07 10:45:41
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

我是用EB洗脱的,我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp,是不是太大了不好连接哦。
16楼2012-05-07 10:46:10
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 14:01:59
引用回帖:
11楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:34:55:
我的目的基因是自己克隆的,连接到pMD19-T载体上,在转化到DH5a中保存菌液,要用的时候直接提取,再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体,前面几次用双酶切,连接不上,上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切,也没有 ...

你载体上PstI和SalI两个酶切位点之间间隔几个bp?如果是相邻的话,双酶切的效率会很低。如果是这样的话,先用酶切效率低的酶去切,然后电泳回收,回收的片段再用另外一个酶去切,酶切时间要长一些。你可以试试看。
未来不是梦
17楼2012-05-07 10:48:07
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amilie030312

金虫 (正式写手)

就连接反应来讲4碱基突出的末端是最好连的,室温15分钟就可以了,酶切后鉴定下如果没问题就肯定链接也没问题啊,因为链接出问题的可能性比较小。
18楼2012-05-07 14:39:32
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honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
15楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:45:41:
我是用EB洗脱的,我可以试一下去离子水脱洗。目的片段有1200bp,是不是太大了不好连接哦。

2000BP以下的属于正常大小。这个范围的片段荧光很好连的。
天下事有难易乎?为之,则难者亦易矣;不为,则易者亦难矣。
19楼2012-05-07 17:19:28
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一度冰火

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-18 18:56:25
如果你确定你的目的基因和2300的双酶切回收都没问题的话,没连上可能是连接时间不够,连接20小时以上试试,还有,你的凝胶回收浓度不够的话可以在最后用EB洗脱液洗CP3管的时候,重复洗几次,这样CP3管上的DNA就能尽可能多的被洗下来了。
快来找我吧!
20楼2012-05-18 18:15:46
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