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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建,需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因,产生相同的粘性末端后连接,但就是连接不上,就高手指教!
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张宏宇123

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-05-07 14:01:59
引用回帖:
11楼: Originally posted by Minnie-zhang at 2012-05-07 10:34:55:
我的目的基因是自己克隆的,连接到pMD19-T载体上,在转化到DH5a中保存菌液,要用的时候直接提取,再酶切。连接载体我用的是pucc2300载体,前面几次用双酶切,连接不上,上一次先用Sal1酶切再用Pst1单酶切,也没有 ...

你载体上PstI和SalI两个酶切位点之间间隔几个bp?如果是相邻的话,双酶切的效率会很低。如果是这样的话,先用酶切效率低的酶去切,然后电泳回收,回收的片段再用另外一个酶去切,酶切时间要长一些。你可以试试看。
未来不是梦
17楼2012-05-07 10:48:07
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guishen10

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试
2楼2012-05-04 16:14:53
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guishen10 at 2012-05-04 16:14:53:
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试

我已经做过四次了,每次都是过夜连接。前面三次在酶切质粒载体2300时用的是双酶切,没做出来,这一次我用的是单酶切,但是载体回收浓度很低,就是担心啊 !
3楼2012-05-04 16:31:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
单酶切难度更哦,尽量用双酶切吧。
Thank-you,so-blue.
4楼2012-05-04 16:42:10
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