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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建,需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因,产生相同的粘性末端后连接,但就是连接不上,就高手指教!
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选?
还有就是你载体有没有突变,或者是目的片段有没有突变,如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上,我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓,主要是片段尽可能多一些。
你 ...

我的目的基因是自己克隆,并且已经测序出来的基因,叫ABR1基因。我先把该基因连接到pMD19-T上,在转化到DH5a中保存菌液。要做酶切的时候直接提取后在酶切。至于连接载体,我用的是Pucc2300质粒载体,用Sal1和Pst1酶切。我用双酶切没连接上,上次用单酶切还是没有连接上。我2300质粒载体的浓度不高,是不是这个的问题?
9楼2012-05-07 10:29:21
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guishen10

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试
2楼2012-05-04 16:14:53
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guishen10 at 2012-05-04 16:14:53:
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试

我已经做过四次了,每次都是过夜连接。前面三次在酶切质粒载体2300时用的是双酶切,没做出来,这一次我用的是单酶切,但是载体回收浓度很低,就是担心啊 !
3楼2012-05-04 16:31:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
单酶切难度更哦,尽量用双酶切吧。
Thank-you,so-blue.
4楼2012-05-04 16:42:10
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