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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 双酶切粘性末端连接不上
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建，需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因，产生相同的粘性末端后连接，但就是连接不上，就高手指教！
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1楼 2012-05-04 15:52:13
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张宏宇123 at 2012-05-04 20:45:13:
你载体有没有蓝白筛选？
还有就是你载体有没有突变，或者是目的片段有没有突变，如果有的话导致两端都是同一种粘性末端的话肯定连不上，我以前遇到过这种问题。
载体浓度低无所谓，主要是片段尽可能多一些。
你 ...

我的目的基因是自己克隆，并且已经测序出来的基因，叫ABR1基因。我先把该基因连接到pMD19-T上，在转化到DH5a中保存菌液。要做酶切的时候直接提取后在酶切。至于连接载体，我用的是Pucc2300质粒载体，用Sal1和Pst1酶切。我用双酶切没连接上，上次用单酶切还是没有连接上。我2300质粒载体的浓度不高，是不是这个的问题？
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9楼2012-05-07 10:29:21
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guishen10

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍，过夜连接试试
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2楼2012-05-04 16:14:53
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by guishen10 at 2012-05-04 16:14:53:
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍，过夜连接试试

我已经做过四次了，每次都是过夜连接。前面三次在酶切质粒载体2300时用的是双酶切，没做出来，这一次我用的是单酶切，但是载体回收浓度很低，就是担心啊 ！
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3楼2012-05-04 16:31:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
单酶切难度更哦，尽量用双酶切吧。
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Thank-you，so-blue.
4楼2012-05-04 16:42:10
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