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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

[求助] 双酶切粘性末端连接不上

本人正在超表达载体构建,需要用Pst1和Sal1双酶切质粒2300载体和目的基因,产生相同的粘性末端后连接,但就是连接不上,就高手指教!
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honinglee

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2012-05-05 13:35:48
两个建议:1切后回收的片段用65度的去离子水溶最好 不要用试剂盒里自己的EB洗脱,它里有盐,影响连接效率的。
2:不知道2300载体上两个位点隔多远?太近的话容易只单酶切。可以先单酶切后面的那个点,再单切前面的那个点,各一个小时足以;酶切后的大载体用去磷酸酶处理一下,防止自连。同时NEB的这两个酶都有HF的,防止星号活性产生。
天下事有难易乎?为之,则难者亦易矣;不为,则易者亦难矣。
7楼2012-05-05 00:08:45
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guishen10

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试
2楼2012-05-04 16:14:53
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Minnie-zhang

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by guishen10 at 2012-05-04 16:14:53:
载体和目的片段比保持目的片段为载体的五到七倍,过夜连接试试

我已经做过四次了,每次都是过夜连接。前面三次在酶切质粒载体2300时用的是双酶切,没做出来,这一次我用的是单酶切,但是载体回收浓度很低,就是担心啊 !
3楼2012-05-04 16:31:31
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
单酶切难度更哦,尽量用双酶切吧。
Thank-you,so-blue.
4楼2012-05-04 16:42:10
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