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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 土壤总细菌16S PCR-条带不亮的问题
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 土壤总细菌16S PCR-条带不亮的问题

本人打算做T-RFLP，现在正在做土壤总细菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR体系是：25ul体系：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer缓冲液（5U/uL），模板0.5uL，以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1 min，30 个循环，72℃下延伸10min。按照这个条件，能够P出条带，但是问题是条带不亮，甚至marker都不亮。期间，也换过EB染色液、TAE，但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。


[ Last edited by liuxing1-1 on 2012-4-19 at 10:05 ]
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1楼 2012-04-19 10:00:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

bear0329

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-04-22 10:43:48
根据你的MARKER亮度来看的话，扩增的应该还可以的，是不是胶的问题或者是成像系统没有调好
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以马内利！
7楼2012-04-21 23:35:46
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普通回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2, ★有帮助 2012-04-19 15:57:52
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-20 13:37:09
这样说的话应该是电泳槽的问题，有的时候电泳槽会很热，这时候你电泳电压过高的话就会造成条带不齐，在一个就是胶的浓度，你可以提高一下胶的浓度试一下
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-04-19 15:56:30
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-19 15:56:30:
这样说的话应该是电泳槽的问题，有的时候电泳槽会很热，这时候你电泳电压过高的话就会造成条带不齐，在一个就是胶的浓度，你可以提高一下胶的浓度试一下

我用过1.5%和2%的琼脂糖凝胶，但是效果都不行
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3楼2012-04-19 15:58:39
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-04-20 08:18:03
其实这个亮度还可以，不排除胶做的太厚，可以多然一段时间啊，号不排除凝胶成像系统的牌照问题哦~
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生活是面镜子~
4楼2012-04-19 18:23:30
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jingquan

铜虫 (正式写手)
照相系统来回调整一下，焦距，曝光时间，等。
marker的750bp亮度都显出差异了，那就是你照相还有一点要摸索。
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5楼2012-04-19 20:05:47
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:23:30:
其实这个亮度还可以，不排除胶做的太厚，可以多然一段时间啊，号不排除凝胶成像系统的牌照问题哦~

染色最长染过半小时，还不理想
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6楼2012-04-20 08:17:57
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bear0329 at 2012-04-21 23:35:46:
根据你的MARKER亮度来看的话，扩增的应该还可以的，是不是胶的问题或者是成像系统没有调好

不知道啊
换个marker试试看
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8楼2012-04-22 10:44:08
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yaoyl0679

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
土壤基因组提的不好，导致扩增效果较差
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9楼2012-04-22 16:33:31
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yaoyl0679 at 2012-04-22 16:33:31:
土壤基因组提的不好，导致扩增效果较差

检测过，纯度和含量都行
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10楼2012-04-22 17:56:06
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