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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 土壤总细菌16S PCR-条带不亮的问题
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 土壤总细菌16S PCR-条带不亮的问题

本人打算做T-RFLP，现在正在做土壤总细菌16S PCR，引物是27F和1492R，PCR体系是：25ul体系：dNTP（10UM） 0.5ul, 引物（10UM）各1uL，Taq E 0.5ul，10×buffer缓冲液（5U/uL），模板0.5uL，以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1 min，30 个循环，72℃下延伸10min。按照这个条件，能够P出条带，但是问题是条带不亮，甚至marker都不亮。期间，也换过EB染色液、TAE，但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。


[ Last edited by liuxing1-1 on 2012-4-19 at 10:05 ]
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1楼 2012-04-19 10:00:02
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-19 15:56:30:
这样说的话应该是电泳槽的问题，有的时候电泳槽会很热，这时候你电泳电压过高的话就会造成条带不齐，在一个就是胶的浓度，你可以提高一下胶的浓度试一下

我用过1.5%和2%的琼脂糖凝胶，但是效果都不行
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3楼2012-04-19 15:58:39
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:23:30:
其实这个亮度还可以，不排除胶做的太厚，可以多然一段时间啊，号不排除凝胶成像系统的牌照问题哦~

染色最长染过半小时，还不理想
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6楼2012-04-20 08:17:57
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
7楼: Originally posted by bear0329 at 2012-04-21 23:35:46:
根据你的MARKER亮度来看的话，扩增的应该还可以的，是不是胶的问题或者是成像系统没有调好

不知道啊
换个marker试试看
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8楼2012-04-22 10:44:08
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yaoyl0679 at 2012-04-22 16:33:31:
土壤基因组提的不好，导致扩增效果较差

检测过，纯度和含量都行
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10楼2012-04-22 17:56:06
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yaoyl0679 at 2012-04-23 20:03:58:
不是指DNA的含量，而是提取DNA中存在腐殖质，会影响PCR扩增

那marker呢？怎么解释》？
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12楼2012-04-23 21:14:35
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
13楼: Originally posted by yaoyl0679 at 2012-04-23 22:07:32:
说明胶跑的不好，如果电泳液时间长了就该换电泳液

琼脂粉还是原来的，一直在用，电泳液刚换
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16楼2012-04-24 07:56:18
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
14楼: Originally posted by freerain at 2012-04-24 01:52:40:
你跑过其它的电泳吗？如果marker都存在不亮的情况
看起来是拍照的事情哈，调一下对比度和曝光时间

今天找技术人员来看看凝胶成像系统
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17楼2012-04-24 07:56:43
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)
引用回帖:
15楼: Originally posted by sl35537417 at 2012-04-24 04:46:33:
没必要整地一砣一砣的
只要能切胶回收  测序不就完了吗

主要是怕回收后的浓度不够啊
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18楼2012-04-24 07:57:03
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