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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

[求助] 土壤总细菌16S PCR-条带不亮的问题

本人打算做T-RFLP,现在正在做土壤总细菌16S PCR,引物是27F和1492R,PCR体系是:25ul体系:dNTP(10UM) 0.5ul, 引物(10UM)各1uL,Taq E 0.5ul,10×buffer缓冲液(5U/uL),模板0.5uL,以水补齐。PCR条件是94℃预变性5 min,94℃变性30s,56℃退火30s,72℃延伸1 min,30 个循环,72℃下延伸10min。按照这个条件,能够P出条带,但是问题是条带不亮,甚至marker都不亮。期间,也换过EB染色液、TAE,但问题依旧。大家帮忙分析一下是什么原因吧。


[ Last edited by liuxing1-1 on 2012-4-19 at 10:05 ]
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jingquan

铜虫 (正式写手)

照相系统来回调整一下,焦距,曝光时间,等。
marker的750bp亮度都显出差异了,那就是你照相还有一点要摸索。
5楼2012-04-19 20:05:47
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2, 有帮助 2012-04-19 15:57:52
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-20 13:37:09
这样说的话应该是电泳槽的问题,有的时候电泳槽会很热,这时候你电泳电压过高的话就会造成条带不齐,在一个就是胶的浓度,你可以提高一下胶的浓度试一下
我努力我奋斗我成功
2楼2012-04-19 15:56:30
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liuxing1-1

至尊木虫 (知名作家)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-19 15:56:30:
这样说的话应该是电泳槽的问题,有的时候电泳槽会很热,这时候你电泳电压过高的话就会造成条带不齐,在一个就是胶的浓度,你可以提高一下胶的浓度试一下

我用过1.5%和2%的琼脂糖凝胶,但是效果都不行
3楼2012-04-19 15:58:39
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
liuxing1-1: 金币+2 2012-04-20 08:18:03
其实这个亮度还可以,不排除胶做的太厚,可以多然一段时间啊,号不排除凝胶成像系统的牌照问题哦~
生活是面镜子~
4楼2012-04-19 18:23:30
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