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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于western blot的小问题
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autumnfang

金虫 (初入文坛)

[交流] 关于western blot的小问题

刚开始做western blot ，每次做都是不出结果，我的目的蛋白分子量58kd。
主要问题有1、跑胶之后marker中红色的那一条下面只有两条蓝色的带
                  2、曝光之后胶片没有任何东西。
[/img][/img]
我在想是不是我电转的时间过长，将蛋白转没了
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1楼 2012-04-03 16:11:19
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

2011加油

银虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-04-04 13:03:00
做WB问题的出处有太多环节。电泳、电转、一抗/二抗孵育、曝光时间长短、显影液等。你是进行ECL发光吗？首先你先确认发光时看到荧光没有？如果没有，问题极有可能存在于之前的环节。如蛋白的上样量，电泳液的PH，电转的时间，PVDF膜的前处理（最好后面不晾干），一抗、二抗连接的类型是否匹配。现在刚开始尝试做WB，建议你:首先做两块胶，一块用于考染，脱色后若有条带，则另一块用于摸索电转的条件。保证一步步没问题。
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6楼2012-04-03 21:28:46
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autumnfang

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by userhung at 2012-04-03 16:41:22:
操作上是否有问？

我注意操作了 只是实验过程中pvdf膜稍微有些干
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3楼2012-04-03 17:22:07
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普通回帖

userhung

禁虫 (文学泰斗)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
操作上是否有问？
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2楼2012-04-03 16:41:22
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超然渡陈

金虫 (小有名气)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
你转膜的时候用的电压和电流分别是多少？转膜多长时间？建议你转膜之后用考马斯蓝染液对胶进行染色，膜上没有蛋白的话要看一下蛋白是否残留在胶上。
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4楼2012-04-03 20:17:43
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308630949

银虫 (小有名气)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
你可以用染色胶，也可以用丽春红染色pvdf膜，丽春红可逆，可以冲洗后继续下面的工作，效果可能不是太好就是，染色膜的话背景最后有点深
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5楼2012-04-03 21:23:39
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国标飞扬

捐助贵宾 (小有名气)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
感觉是电泳时间太久了，用一半的时间试试。
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7楼2012-04-03 22:59:26
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chenhuize

木虫 (正式写手)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
转膜的过程中你可以放两层PVDF膜，这样你怀疑第一张膜上没有蛋白的话，下一张也肯定有。
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8楼2012-04-04 08:56:15
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晴天1882

木虫 (正式写手)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
如果没错，电泳中marker红色的带分子量是72，下面的两条蓝色的带是55和43，你都58应该是在红色和下一条蓝色之间，这都没跑出来，后面肯定显影不出来啦，先看看电泳方面的问题吧！
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9楼2012-04-04 10:38:44
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lxmzhj1984

银虫 (小有名气)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
转膜的时候很重要，看你胶上的marker还在，估计转膜不够彻底。实验结束后可以把膜染色看看转膜效果。
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10楼2012-04-04 10:45:16
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虫儿小

铜虫 (小有名气)
★ ★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-06 17:40:14
中间过程太多了，哪一步出了问题都会导致结果不好，我刚开始做的时候也是，练得时间长了，方法也没怎么变就能有结果了。胶片不显，发光时能不能看到膜上有亮的条带呢？发光液和显影液有没有问题吗？抗体有没有坏啊？这些都没问题就是膜上没转上蛋白，可以看看前面虫友给的建议
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11楼2012-04-06 14:25:46
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jl860822

金虫 (正式写手)
★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
楼主用的是Fermentas的彩虹Marker吧？是不是跑的有点太猛了
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12楼2012-12-18 13:19:29
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shabz

木虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我做的也是上述情况 但是用立春红染色显示有蛋白 可曝光却看不到任何东西
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13楼2013-05-20 09:41:55
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