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autumnfang

金虫 (初入文坛)


[交流] 关于western blot的小问题

刚开始做western blot ,每次做都是不出结果,我的目的蛋白分子量58kd。
主要问题有1、跑胶之后marker中红色的那一条下面只有两条蓝色的带
                  2、曝光之后胶片没有任何东西。
[/img][/img]
我在想是不是我电转的时间过长,将蛋白转没了
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2011加油

银虫 (正式写手)


★ ★ ★ ★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
小丹木木: 金币+3, 鼓励交流 2012-04-04 13:03:00
做WB问题的出处有太多环节。电泳、电转、一抗/二抗孵育、曝光时间长短、显影液等。你是进行ECL发光吗?首先你先确认发光时看到荧光没有?如果没有,问题极有可能存在于之前的环节。如蛋白的上样量,电泳液的PH,电转的时间,PVDF膜的前处理(最好后面不晾干),一抗、二抗连接的类型是否匹配。现在刚开始尝试做WB,建议你:首先做两块胶,一块用于考染,脱色后若有条带,则另一块用于摸索电转的条件。保证一步步没问题。
6楼2012-04-03 21:28:46
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autumnfang

金虫 (初入文坛)


引用回帖:
2楼: Originally posted by userhung at 2012-04-03 16:41:22:
操作上是否有问?

我注意操作了 只是实验过程中pvdf膜稍微有些干
3楼2012-04-03 17:22:07
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普通回帖

userhung

禁虫 (文学泰斗)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
操作上是否有问?
2楼2012-04-03 16:41:22
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超然渡陈

金虫 (小有名气)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
你转膜的时候用的电压和电流分别是多少?转膜多长时间?建议你转膜之后用考马斯蓝染液对胶进行染色,膜上没有蛋白的话要看一下蛋白是否残留在胶上。
4楼2012-04-03 20:17:43
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308630949

银虫 (小有名气)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
你可以用染色胶,也可以用丽春红染色pvdf膜,丽春红可逆,可以冲洗后继续下面的工作,效果可能不是太好就是,染色膜的话背景最后有点深
5楼2012-04-03 21:23:39
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国标飞扬

捐助贵宾 (小有名气)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
感觉是电泳时间太久了,用一半的时间试试。
7楼2012-04-03 22:59:26
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chenhuize

木虫 (正式写手)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
转膜的过程中你可以放两层PVDF膜,这样你怀疑第一张膜上没有蛋白的话,下一张也肯定有。
8楼2012-04-04 08:56:15
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晴天1882

木虫 (正式写手)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
如果没错,电泳中marker红色的带分子量是72,下面的两条蓝色的带是55和43,你都58应该是在红色和下一条蓝色之间,这都没跑出来,后面肯定显影不出来啦,先看看电泳方面的问题吧!
9楼2012-04-04 10:38:44
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lxmzhj1984

银虫 (小有名气)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
转膜的时候很重要,看你胶上的marker还在,估计转膜不够彻底。实验结束后可以把膜染色看看转膜效果。
10楼2012-04-04 10:45:16
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虫儿小

铜虫 (小有名气)


★ ★
autumnfang(金币+1): 谢谢参与
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-06 17:40:14
中间过程太多了,哪一步出了问题都会导致结果不好,我刚开始做的时候也是,练得时间长了,方法也没怎么变就能有结果了。胶片不显,发光时能不能看到膜上有亮的条带呢?发光液和显影液有没有问题吗?抗体有没有坏啊?这些都没问题就是膜上没转上蛋白,可以看看前面虫友给的建议
11楼2012-04-06 14:25:46
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jl860822

金虫 (正式写手)



autumnfang(金币+1): 谢谢参与
楼主用的是Fermentas的彩虹Marker吧?是不是跑的有点太猛了
12楼2012-12-18 13:19:29
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shabz

木虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
我做的也是上述情况 但是用立春红染色显示有蛋白 可曝光却看不到任何东西
13楼2013-05-20 09:41:55
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