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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » pcr 带好宽啊!苦恼，求助ing!
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zhu_linying

新虫 (初入文坛)

[求助] pcr 带好宽啊!苦恼，求助ing!

我从土壤中提取总DNA，用细菌通用引物F338-GC/R518，最近pcr出来的结果有两条离的很近的带，目的条带很宽，温度梯度都做了55-66，都是有两条很近的带，求高手相助，万分感谢！！
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1楼 2012-03-20 00:16:58
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

阳光灰灰

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-03-21 17:13:39
既然都做了那么多温度梯度，特异性还是不太好，重新设计引物试试吧，胶的浓度也可以大些，我们有时用3%或4%的
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14楼2012-03-21 09:11:26
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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河
★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！欢迎常来哈~ 2012-03-20 12:01:54
建议使用Mg2+浓度，更换电泳缓冲液，将低电压和电泳时间，调整上样量。感觉是有点弥散和拖尾，祝好
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将相本无种★男儿当自强
2楼2012-03-20 09:03:00
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gaoxiang6521

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~ 条带比较小，提高胶浓度是个好办法！ 2012-03-20 12:03:02
marker条带也不清楚。除改变PCR条件和体系外，
建议：
1、调整拍照的焦点和焦距，以MERKER条带清晰为标准；
2、做胶时充分熔解，并倒胶半小时后等完全凝固再拔梳子；
3、提高胶浓度。

另：楼主的marker可是DL2000?
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3楼2012-03-20 09:30:09
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whb21

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-03-20 12:03:26
建议你跑一下page或者是将PCR产物稀释后作为模板再进行一下PCR
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4楼2012-03-20 09:40:53
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若水5886

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 赞成！ 2012-03-20 12:03:39
有两条带的原因不在胶或者是上样量大，关键的是你有非特异性条带。
出现这种现象要么是你的引物不够特异，要么就是你的体系或者程序中退火温度有问题啦
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5楼2012-03-20 09:45:37
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zcc3255

木虫 (正式写手)

熊猫

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+1, 鼓励应助 2012-03-21 17:12:29
割胶回收，再PCR下试试
应该是特异性不好，换引物吧
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6楼2012-03-20 12:50:30
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cnb1987

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhu_linying: 金币+1, ★★★★★最佳答案, 我用的就是师姐给的引物，是细菌的通用引物，难道通用引物还不通用还得改么？ 2012-03-20 13:55:44
西瓜: 金币+2, Good！引物设计很重要！ 2012-03-21 17:13:00
童鞋，在PCR的时候你一定要下功夫在引物设计上，我刚开始做的时候也是这种情况，以前用别人设计的引物，怎么扩都扩不出来，扩出来也是你这种情况，引物的特异性不好，现在自己做实验了，自己设计引物，连本科生上手都能扩出来！还有你的体系是什么，是用MIX，还是多组分的，如果体系多的话，可以用不同公司的组份再扩扩！
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7楼2012-03-20 13:15:23
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whb21

木虫 (著名写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by zhu_linying at 2012-03-20 13:52:24:
稀释多少倍啊？然后还是用原来的体系和程序么？循环，时间，温度多不变么，还是减少？麻烦您说具体点，我不太懂，你说的可是recordition PCR？

琼脂糖凝胶电泳的分辨率低，但聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）的就高得多了，可以将弥散的条带分开。
我以前也遇见过这情况，条带宽，稀释PCR产物500-1000倍左右（具体看你产物浓度）还用之前的程序跑一下看看，如果不行，试试提高退火温度
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10楼2012-03-20 15:19:31
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cnb1987

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜: 金币+1, 鼓励应助 2012-03-21 17:13:30
我们不做细菌的，你这个非特异扩增好明显，Marker跑的比条带好，证明还是产物的问题，你再好好优化一下条件，我没有用过通用引物，你再问问你师姐关于引物的情况！如果长时间还没扩出来，就换引物吧！
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13楼2012-03-21 08:33:19
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咖啡加点糖

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你看看大浓度的胶，低电压，长时间跑出来是什么样子，还是不行的话我也觉得应该换引物了！祝顺利
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16楼2012-03-21 09:48:46
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普通回帖

zhu_linying

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by gaoxiang6521 at 2012-03-20 09:30:09:
marker条带也不清楚。除改变PCR条件和体系外，
建议：
1、调整拍照的焦点和焦距，以MERKER条带清晰为标准；
2、做胶时充分熔解，并倒胶半小时后等完全凝固再拔梳子；
3、提高胶浓度。

另：楼主的marker可是 ...

是2000的，怎么样调整体系可以避免非特异性条带的出现呢，还是有别的更好的PCR方法？
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8楼2012-03-20 13:49:52
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zhu_linying

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by whb21 at 2012-03-20 09:40:53:
建议你跑一下page或者是将PCR产物稀释后作为模板再进行一下PCR

稀释多少倍啊？然后还是用原来的体系和程序么？循环，时间，温度多不变么，还是减少？麻烦您说具体点，我不太懂，你说的可是recordition PCR？
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9楼2012-03-20 13:52:24
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