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zhu_linying

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 29.5
帖子: 16
在线: 7.9小时
虫号: 1698733
注册: 2012-03-17
专业: 环境微生物学

[求助] pcr 带好宽啊!苦恼，求助ing!

我从土壤中提取总DNA，用细菌通用引物F338-GC/R518，最近pcr出来的结果有两条离的很近的带，目的条带很宽，温度梯度都做了55-66，都是有两条很近的带，求高手相助，万分感谢！！

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1楼 2012-03-20 00:16:58

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gaoxiang6521

铁杆木虫 (著名写手)

应助: 1 (幼儿园)
金币: 20993.4
散金: 20
帖子: 2328
在线: 31.1小时
虫号: 598270
注册: 2008-09-10
性别: MM
专业: 病原细菌、细菌感染与宿主

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励交流~ 条带比较小，提高胶浓度是个好办法！ 2012-03-20 12:03:02

marker条带也不清楚。除改变PCR条件和体系外，
建议：
1、调整拍照的焦点和焦距，以MERKER条带清晰为标准；
2、做胶时充分熔解，并倒胶半小时后等完全凝固再拔梳子；
3、提高胶浓度。

另：楼主的marker可是DL2000?

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3楼2012-03-20 09:30:09

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rommel1941

铁杆木虫 (正式写手)

情定山河

MolEPI: 4
应助: 52 (初中生)
金币: 8144.7
散金: 269
红花: 6
帖子: 694
在线: 110.8小时
虫号: 67197
注册: 2005-05-05
性别: GG
专业: 分子与进化生态学

★ ★
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！欢迎常来哈~ 2012-03-20 12:01:54

建议使用Mg2+浓度，更换电泳缓冲液，将低电压和电泳时间，调整上样量。感觉是有点弥散和拖尾，祝好

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将相本无种★男儿当自强

2楼2012-03-20 09:03:00

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whb21

木虫 (著名写手)

MolEPI: 1
应助: 105 (高中生)
金币: 9711.3
散金: 625
红花: 7
帖子: 2994
在线: 172.4小时
虫号: 928584
注册: 2009-12-15
性别: GG
专业: 微生物生理与生物化学

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励应助！ 2012-03-20 12:03:26

建议你跑一下page或者是将PCR产物稀释后作为模板再进行一下PCR

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4楼2012-03-20 09:40:53

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若水5886

新虫 (小有名气)

MolEPI: 1
应助: 46 (小学生)
金币: 19.1
散金: 140
帖子: 218
在线: 43.8小时
虫号: 707846
注册: 2009-02-24
专业: 蛋白质组学

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 赞成！ 2012-03-20 12:03:39

有两条带的原因不在胶或者是上样量大，关键的是你有非特异性条带。
出现这种现象要么是你的引物不够特异，要么就是你的体系或者程序中退火温度有问题啦

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5楼2012-03-20 09:45:37

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