24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 1360  |  回复: 13

1397717

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR程序设置

现在在做一个PCR扩增实验,引物和DNA都有,请问如何设置PCR程序?
     Tm值在引物设计的时候已经确定了,扩增片段大小分别为431bp和671bp,那延伸时间和循环次数如何确定? 谢谢!

[ Last edited by 1397717 on 2012-3-5 at 14:26 ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ZOEY21

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:57:52
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 10:58:58
即使你设计引物时确定了Tm值,正式试验时还是要摸索,这很重要。一般比引物合成报告单给出的低5度。建议你还是做个退火温度的梯度试验摸索下。
延伸时间和循环数个人觉得不是影响PCR的关键。你可以参照前人做的类似物种采取的反应程序。过多容易产生非特异带,过少产物不足。
一点拙见,不对地方请指正。
3楼2012-03-05 14:56:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

chubing

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
普通pcr一般延伸时间是1imin.30-35个循环。
2楼2012-03-05 14:44:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

纸船

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:58:02
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:58:19
1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:59:24
退火温度跟理论Tm值是有差别的,建议做下梯度PCR,你这么长的片段,延伸30S足够了,循环次数建议30-35.
4楼2012-03-05 15:11:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cgspider

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+2): 鼓励应助 2012-03-07 12:13:57
500左右的片段。
94度  30s
退火   30s
72度   1min                       32个循环就可以了。。

看结果,然后调整退火温度。。。
你的能力撑不起你的野心
5楼2012-03-05 15:20:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 10:59:35
楼上基本说全了,补充一点,如果你用Taq酶,则其工作速度大约为1000bp/min,若用KOD酶,则2000bp/min,你可以根据这些条件进一步优化你的扩增步骤
我努力我奋斗我成功
6楼2012-03-05 16:28:30
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

youngsun50

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
同意3楼,一般设置低于Tm 5度,但还应先摸索梯度温度,一般55度左右
学会感恩,强大自我
7楼2012-03-05 17:36:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tapmun

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
一般根据文献中的引物及相应的程序吧,试着做下,再慢慢摸索,我也摸索中
业精于勤荒于嬉,行成于思而毁于随
8楼2012-03-05 19:10:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yanxiaoqian

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
内容已删除
9楼2012-03-05 19:34:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

andyleier

铁虫 (初入文坛)

最好多设计几个梯度,要摸索,说明书上的有时候不准。看看哪个温度,浓度,时间好。
10楼2012-03-05 21:06:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 1397717 的主题更新
信息提示
请填处理意见