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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR程序设置
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1397717

新虫 (初入文坛)

[求助] PCR程序设置

现在在做一个PCR扩增实验，引物和DNA都有，请问如何设置PCR程序？
     Tm值在引物设计的时候已经确定了，扩增片段大小分别为431bp和671bp，那延伸时间和循环次数如何确定？ 谢谢！

[ Last edited by 1397717 on 2012-3-5 at 14:26 ]
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1楼 2012-03-05 14:22:53
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ZOEY21

金虫 (小有名气)

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1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:57:52
小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 10:58:58
即使你设计引物时确定了Tm值，正式试验时还是要摸索，这很重要。一般比引物合成报告单给出的低5度。建议你还是做个退火温度的梯度试验摸索下。
延伸时间和循环数个人觉得不是影响PCR的关键。你可以参照前人做的类似物种采取的反应程序。过多容易产生非特异带，过少产物不足。
一点拙见，不对地方请指正。
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3楼2012-03-05 14:56:44
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普通回帖

chubing

新虫 (初入文坛)

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普通pcr一般延伸时间是1imin.30-35个循环。
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2楼2012-03-05 14:44:58
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纸船

铜虫 (小有名气)

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1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:58:02
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1397717(金币+5): ★★★很有帮助 2012-03-06 09:59:24
退火温度跟理论Tm值是有差别的，建议做下梯度PCR，你这么长的片段，延伸30S足够了，循环次数建议30-35.
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4楼2012-03-05 15:11:46
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cgspider

木虫 (正式写手)

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西瓜(金币+2): 鼓励应助 2012-03-07 12:13:57
500左右的片段。
94度  30s
退火   30s
72度   1min                       32个循环就可以了。。

看结果，然后调整退火温度。。。
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你的能力撑不起你的野心
5楼2012-03-05 15:20:21
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cheng_xiao

木虫 (小有名气)

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小丹木木(金币+1): 鼓励应助 2012-03-06 10:59:35
楼上基本说全了，补充一点，如果你用Taq酶，则其工作速度大约为1000bp/min，若用KOD酶，则2000bp/min，你可以根据这些条件进一步优化你的扩增步骤
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我努力我奋斗我成功
6楼2012-03-05 16:28:30
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youngsun50

木虫 (正式写手)

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同意3楼，一般设置低于Tm 5度，但还应先摸索梯度温度，一般55度左右
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学会感恩，强大自我
7楼2012-03-05 17:36:43
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tapmun

木虫 (著名写手)

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一般根据文献中的引物及相应的程序吧，试着做下，再慢慢摸索，我也摸索中
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业精于勤荒于嬉，行成于思而毁于随
8楼2012-03-05 19:10:59
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yanxiaoqian

新虫 (初入文坛)

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9楼2012-03-05 19:34:32
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andyleier

铁虫 (初入文坛)
最好多设计几个梯度，要摸索，说明书上的有时候不准。看看哪个温度，浓度，时间好。
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10楼2012-03-05 21:06:13
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