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karin

木虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌表达蛋白提取总不成功，求助高手指教！

基因克隆后在大肠杆菌中以包涵体形式大量表达，想提取包涵体蛋白。一般用超声方法破碎细胞，再用2M、8M尿素洗涤包涵体后，蛋白就大部分溶解在8M尿素溶液中。但本人先是超声处理，再是加溶菌酶同时超声，结果都不理想，8M尿素溶液中蛋白量很低，大部分蛋白还是在沉淀中。超声时间由短到长也都试了。求高手帮忙啊！
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坚持就是胜利
1楼2012-02-16 14:08:29
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karin

木虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by tangwq at 2012-02-17 22:48:51:
看你想做什么后续实验了，建议你换标签。一般来说用MBP标签可以帮助蛋白处于溶解状体，而且MBP融合蛋白表达超高，很容易纯化。问题是MBP标签太大有可能影响蛋白活性。GST标签也不错，也能帮助蛋白溶解，效果不如M ...

很有帮助，谢谢！
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坚持就是胜利
3楼2012-02-18 08:30:00
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tangwq

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+2): 鼓励应助哦 2012-02-18 08:22:54
karin(金币+3): ★★★很有帮助 2012-02-18 08:29:10
看你想做什么后续实验了，建议你换标签。一般来说用MBP标签可以帮助蛋白处于溶解状体，而且MBP融合蛋白表达超高，很容易纯化。问题是MBP标签太大有可能影响蛋白活性。GST标签也不错，也能帮助蛋白溶解，效果不如MBP好。可以尝试18度3-6小时甚至4度过夜诱导，蛋白慢慢表达会增加溶解性。一般来说用变性条件从包涵体中纯化蛋白是最后的选择。之前应该尝试各种办法让蛋白可溶表达
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2楼2012-02-17 22:48:51
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jacky1985310

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
karin: 金币+1, ★有帮助 2012-06-28 08:18:29
如果获得蛋白后想要做pulldown或其他活性检测的话最好不用尿素等变性剂，那样会涉及到复性之后活性是否回复的问题，还是要摸很多条件。
莫不如把精力花在蛋白表达上，争取使其可溶是最好的选择
二楼的建议很专业，早看到这个MBP的建议我就不用自己挣扎那么久才换这个标签了。。。不过全当是练手了
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4楼2012-06-27 19:07:43
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sk_yb

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
karin: 金币+1, ★有帮助, 谢啦 2012-06-28 08:19:01
纯包涵体不是个简单的事，有时纯出来也没有活性。建议更换载体，或直接换标签。再摸索一下最优条件
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5楼2012-06-27 20:59:43
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