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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助从动物体提取某种特定蛋白的方法
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冰凝草

木虫 (小有名气)

[求助] 求助从动物体提取某种特定蛋白的方法

最近老板让我从动物体内提取某种蛋白，我说用活体采样，然后粉碎组织后再用层析或者饱和硫酸铵析出的方法提取总蛋白。但是后续不知道该怎么做。而且老板说我之前的方法也不对。跪求前辈们赐教怎么做这个实验呢，有没有相关的文献可以推荐，不甚感激
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1楼 2013-09-15 16:53:25
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
冰凝草: 金币+8, ★★★很有帮助 2013-09-19 21:33:35
gyesang: 金币+2, 专家考核！ 2013-09-20 00:22:48
用高浓度的盐溶液变性后的蛋白质一般用透析超滤处理除去盐离子后能够复性，也可以用分子筛层析除去盐，顺便根据分子量进行分离。
从头做分离注意几个问题：
1.查文献或者数据库，确定蛋白分子量大小、等电点等性质。
2.确定该蛋白质在动物体内的各个器官组织中的分布情况，在前处理时期一定要选用富含该蛋白质的动物的相应的器官和组织用作粗分离的原料。
3.确定该蛋白质是不是膜蛋白质，是的话在粉碎组织后的抽提阶段要加入表面活性剂把膜蛋白质从膜上拉下来；不是膜蛋白，一般不必要用表面活性剂，至少不做电泳的话一般不要用表面活性剂增溶。
4.细分离阶段根据蛋白质的特征，安排不同的操作步骤，一般在细分离阶段之前可先使用沉淀浓缩蛋白质，比如盐析、有机试剂沉淀、聚乙二醇沉淀等，获得蛋白质沉淀后要重新溶解，并且用过滤、超滤和透析除去沉淀剂。一般不要用强变性剂和加热引起蛋白质沉淀，以免变性无法逆转。离子交换层析或者疏水层析，然后用凝胶层析，如果用能够获得该种蛋白质的标准品的话，可以制备出抗体，则可用亲和层析，或者能够知道该蛋白的专一性配体的话（可以从数据库获得资料）也可以使用亲和层析，否则亲和层析这步就做不了，只能在检验该蛋白质产品纯度不够的话再做一轮或多轮离子交换层析或者疏水层析，然后用凝胶层析。当然经过了各种层析方法，纯化出来的目地蛋白质的浓度要比上样前的浓度更低不少，不过浓缩到也不难，用超滤即可。
5.检测纯度，可以用溶解法或者MS测定分子量或电泳。理论上电泳方法也可以用于分离提纯，但是因为从凝胶中回收蛋白质的话还要在纯化目的蛋白质，所以我不主张使用电泳方法也可以用于分离提纯，尤其是若用SDS-PAGE要在上样前加热变性蛋白质，能够复性很难说。
6.对于分离提纯的蛋白质的所有操作一般适宜在零度到四度范围内，可以在有空调的房间进行并将空调温度调低，必要的话，须在有关设备周围固着冰块。
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5楼2013-09-19 21:05:13
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★ ★
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-25 11:41:16
内容已删除
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9楼2013-09-19 22:37:26
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普通回帖

同东中郎将

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。 2013-09-17 14:47:18
冰凝草: 金币+2, ★有帮助 2013-09-18 09:20:56
提取样品上清，硫酸铵沉淀，再复溶蛋白，过个疏水柱。
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曾子曰：“士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎？死而后已，不亦远乎？”
2楼2013-09-17 14:43:02
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shenhaiwang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
冰凝草: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-18 09:21:07
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-20 00:22:29
1、查文献，确定蛋白分子量大小、等电点等性质；2、取活体组织，组织捣碎，离心取上清；3、将上清蛋白粗提液进行分级硫酸铵沉淀，确定目的蛋白沉淀的硫酸铵饱和度；3、进行离子交换层析、或者疏水层析，改变层析条件，分析目的蛋白纯度；如果目的蛋白与杂蛋白差别比较大，可以过分子筛凝胶柱。
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3楼2013-09-17 15:25:04
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冰凝草

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by shenhaiwang at 2013-09-17 15:25:04
1、查文献，确定蛋白分子量大小、等电点等性质；2、取活体组织，组织捣碎，离心取上清；3、将上清蛋白粗提液进行分级硫酸铵沉淀，确定目的蛋白沉淀的硫酸铵饱和度；3、进行离子交换层析、或者疏水层析，改变层析条件 ...

你好，能具体说下分子量大小和等电点以及那个硫酸铵分级的选择么，还有如果我想保持那个蛋白的活性，是不是用高盐浓度不大好呢。谢谢
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4楼2013-09-19 17:06:16
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冰凝草

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-09-19 21:05:13
用高浓度的盐溶液变性后的蛋白质一般用透析超滤处理除去盐离子后能够复性，也可以用分子筛层析除去盐，顺便根据分子量进行分离。
从头做分离注意几个问题：
1.查文献或者数据库，确定蛋白分子量大小、等电点等性质 ...

说的和我查到的一些资料很相似，嗯，能提供一些关于层析的方法或者是比较好用的试剂盒么
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6楼2013-09-19 21:33:17
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
层析的方法倒是有现成的材料，我一会儿传本书给你吧。
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7楼2013-09-19 21:54:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
冰凝草: 金币+5, ★★★很有帮助 2013-09-20 09:26:31
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-28 22:48:12
引用回帖:
6楼: Originally posted by 冰凝草 at 2013-09-19 21:33:17
说的和我查到的一些资料很相似，嗯，能提供一些关于层析的方法或者是比较好用的试剂盒么...

Guide to Protein Purification(2nd edition)METHODS IN ENZYMOLOGY Vol-463
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=6382232&fpage=1
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8楼2013-09-19 22:36:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-28 22:48:18
内容已删除
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10楼2013-09-19 23:10:07
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