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冰凝草木虫 (小有名气)
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[求助]
求助从动物体提取某种特定蛋白的方法
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| 最近老板让我从动物体内提取某种蛋白，我说用活体采样，然后粉碎组织后再用层析或者饱和硫酸铵析出的方法提取总蛋白。但是后续不知道该怎么做。而且老板说我之前的方法也不对。跪求前辈们赐教怎么做这个实验呢，有没有相关的文献可以推荐，不甚感激 |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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gyesang: 金币+2, 专家考核！ 2013-09-20 00:22:48
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用高浓度的盐溶液变性后的蛋白质一般用透析超滤处理除去盐离子后能够复性，也可以用分子筛层析除去盐，顺便根据分子量进行分离。 从头做分离注意几个问题： 1.查文献或者数据库，确定蛋白分子量大小、等电点等性质。 2.确定该蛋白质在动物体内的各个器官组织中的分布情况，在前处理时期一定要选用富含该蛋白质的动物的相应的器官和组织用作粗分离的原料。 3.确定该蛋白质是不是膜蛋白质，是的话在粉碎组织后的抽提阶段要加入表面活性剂把膜蛋白质从膜上拉下来；不是膜蛋白，一般不必要用表面活性剂，至少不做电泳的话一般不要用表面活性剂增溶。 4.细分离阶段根据蛋白质的特征，安排不同的操作步骤，一般在细分离阶段之前可先使用沉淀浓缩蛋白质，比如盐析、有机试剂沉淀、聚乙二醇沉淀等，获得蛋白质沉淀后要重新溶解，并且用过滤、超滤和透析除去沉淀剂。一般不要用强变性剂和加热引起蛋白质沉淀，以免变性无法逆转。离子交换层析或者疏水层析，然后用凝胶层析，如果用能够获得该种蛋白质的标准品的话，可以制备出抗体，则可用亲和层析，或者能够知道该蛋白的专一性配体的话（可以从数据库获得资料）也可以使用亲和层析，否则亲和层析这步就做不了，只能在检验该蛋白质产品纯度不够的话再做一轮或多轮离子交换层析或者疏水层析，然后用凝胶层析。当然经过了各种层析方法，纯化出来的目地蛋白质的浓度要比上样前的浓度更低不少，不过浓缩到也不难，用超滤即可。 5.检测纯度，可以用溶解法或者MS测定分子量或电泳。理论上电泳方法也可以用于分离提纯，但是因为从凝胶中回收蛋白质的话还要在纯化目的蛋白质，所以我不主张使用电泳方法也可以用于分离提纯，尤其是若用SDS-PAGE要在上样前加热变性蛋白质，能够复性很难说。 6.对于分离提纯的蛋白质的所有操作一般适宜在零度到四度范围内，可以在有空调的房间进行并将空调温度调低，必要的话，须在有关设备周围固着冰块。 |
5楼2013-09-19 21:05:13
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8楼2013-09-19 22:36:26
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