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wenmingfu木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+1):热心鼓励。 2010-11-02 17:12:36
wenmingfu(金币+2): 2010-11-03 15:20:51
wenmingfu(金币+5): 2011-03-24 21:58:20
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Lysis Buffer 1. 100 mM Tris---HCL PH8.3 (50 ml 1M Tris) 2. 500 mM KCL (18.73 g ) 3. 0.1% Gelatin (0.5 g ) 4. 0.45% NP40 (2.25 ml ) 5. 0.45% Tween---20 (2.25 ml ) + H2O =500ml 用的时候加入PK 水浴55度过夜。第二天100度灭活，冷却至4度后可以直接进行PCR鉴定 |
2楼2010-11-02 15:20:56
fzfangtao
木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+3):谢谢交流。 2010-11-02 19:13:50
wenmingfu(金币+3): 2010-11-03 15:21:24
wenmingfu(金币+3): 2011-03-24 21:57:55
dhd997(金币+3):谢谢交流。 2010-11-02 19:13:50
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1. 组织样品和培养细胞的裂解 （1）组织样品 ① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。 ② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。 ③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 （2）培养细胞 ①单层培养细胞 i.从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鲜的冰冷的TBS。 ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。 iii.于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。 iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。 v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 ②悬浮培养的细胞 i.将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。 ii.用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。 iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 iv.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。 3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液中。 4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。 5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min 以温和地混合两相。 6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。 7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。 8.苯酚抽提两次，收集水相。 9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。 10.DNA随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。 11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。 12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。 13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。 14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。 |
3楼2010-11-02 17:20:28
zhanglin_84
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6楼2010-11-13 16:36:25
zhinuo1001
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7楼2013-01-09 10:52:32
wenwen4599
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xy656691: 金币+2, 应助指数+1 2013-01-11 21:45:24
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| 看你做的是什么类群的动物了。如果是保护动物的话只能取毛发、粪便、血液这些提取DNA，最好去买个试剂盒提吧，比如我们这里常用的Axygen的。如果是普通的动物，个体又比较大的话可以直接解剖取组织。我们这里用的是比较原始的酚氯仿方法，直接取样用剪刀剪碎。一般都用自己配制的裂解缓冲液，具体的配方你可以参考《分子克隆指南》。取一个火柴头大小的新鲜样品（如果是酒精保存的样品，需要先用双蒸水脱醇）置于裂解缓冲液中，用干净的剪刀剪碎，一直剪到看不到明显的大颗粒，有条件的话也可以用电动匀浆器粉碎。组织悬浮液中加入蛋白酶K，于55℃水浴中消化6-8小时。如果不好消化的时候也可以消化过夜。但最好不要超过16个小时。之后的操作就是经典的酚氯仿抽提方法了。第一次加入与消化液等体积的饱和酚，上下颠倒混匀15min，8000rpm离心10min，取上清；第二次向上清中加入1/2体积饱和酚，1/2体积氯仿-异戊醇（貌似比例是13:2，试剂公司有配好的卖），上下颠倒混匀15min，8000rpm离心10min，取上清；要注意不要将上清液和下面的有机溶剂中间分界线上的白色蛋白质吸上来。如果觉得吸上来了可以重复第二步；第三次向上清中加入等体积氯仿-异戊醇，上下颠倒混匀15min，8000rpm离心10min，取上清。然后向上清液中加入2倍体积无水乙醇或等体积异丙醇沉淀DNA，这步要加NaAc的，具体的量可以看《分子克隆指南》。上下颠倒混匀后加无水乙醇的可以放4℃1小时或是-20℃ ≥8h充分沉淀。异丙醇可以在室温静置1h。之后12000rpm离心，弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀后，置于室温风干。最后用双蒸水溶解就可以了。 |
8楼2013-01-11 11:43:35
9楼2013-01-21 20:49:41
