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wenmingfu

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】求动物组织DNA提取方法已有3人参与

求动物组织DNA提取方法
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1楼2010-11-02 14:53:52
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丽羽寒梅

铁虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
DNA的提取可以参照生物实验中的猪肝的DNA的提取方法
赞一下 回复此楼
能认识你们是我的荣幸！
9楼2013-01-21 20:49:41
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feng__

金虫 (著名写手)

雾~蝶
★
dhd997(金币+1):热心鼓励。 2010-11-02 17:12:36
wenmingfu(金币+2): 2010-11-03 15:20:51
wenmingfu(金币+5): 2011-03-24 21:58:20
Lysis   Buffer

1. 100  mM    Tris---HCL   PH8.3   (50 ml   1M  Tris)
2. 500  mM     KCL               (18.73 g )
3. 0.1%         Gelatin             (0.5 g )
4. 0.45%        NP40               (2.25 ml )
5. 0.45%        Tween---20          (2.25 ml )
        + H2O =500ml  
用的时候加入PK   水浴55度过夜。第二天100度灭活，冷却至4度后可以直接进行PCR鉴定
赞一下(1人) 回复此楼
会不会偶尔也会想起我....
2楼2010-11-02 15:20:56
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fzfangtao

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3):谢谢交流。 2010-11-02 19:13:50
wenmingfu(金币+3): 2010-11-03 15:21:24
wenmingfu(金币+3): 2011-03-24 21:57:55
1. 组织样品和培养细胞的裂解
（1）组织样品
① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。
② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。
③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
（2）培养细胞
①单层培养细胞
i.从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鲜的冰冷的TBS。
ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。
iii.于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。
iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。
v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
②悬浮培养的细胞
i.将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。
ii.用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。
iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。
iv.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。
  
2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。
3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液中。
4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。
5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min 以温和地混合两相。
6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。
7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。
8.苯酚抽提两次，收集水相。
9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。
10.DNA随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。
11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。
12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。
13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。
14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。
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3楼2010-11-02 17:20:28
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zhanglin_84

木虫 (正式写手)
wenmingfu(金币+2): 2010-11-03 15:21:31
wenmingfu(金币+3): 2011-03-24 21:57:32
你可以去CNKI下一篇关于大熊猫粪便提取的方法试试
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4楼2010-11-02 21:55:47
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