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wenmingfu木虫 (著名写手)
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zhanglin_84
木虫 (正式写手)
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4楼2010-11-02 21:55:47
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dhd997(金币+1):热心鼓励。 2010-11-02 17:12:36
wenmingfu(金币+2): 2010-11-03 15:20:51
wenmingfu(金币+5): 2011-03-24 21:58:20
dhd997(金币+1):热心鼓励。 2010-11-02 17:12:36
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wenmingfu(金币+5): 2011-03-24 21:58:20
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Lysis Buffer 1. 100 mM Tris---HCL PH8.3 (50 ml 1M Tris) 2. 500 mM KCL (18.73 g ) 3. 0.1% Gelatin (0.5 g ) 4. 0.45% NP40 (2.25 ml ) 5. 0.45% Tween---20 (2.25 ml ) + H2O =500ml 用的时候加入PK 水浴55度过夜。第二天100度灭活，冷却至4度后可以直接进行PCR鉴定 |
2楼2010-11-02 15:20:56
fzfangtao
木虫 (正式写手)
- 应助: 9 (幼儿园)
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- 注册: 2010-09-27
- 专业: 植物进化生物学
★ ★ ★
dhd997(金币+3):谢谢交流。 2010-11-02 19:13:50
wenmingfu(金币+3): 2010-11-03 15:21:24
wenmingfu(金币+3): 2011-03-24 21:57:55
dhd997(金币+3):谢谢交流。 2010-11-02 19:13:50
wenmingfu(金币+3): 2010-11-03 15:21:24
wenmingfu(金币+3): 2011-03-24 21:57:55
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1. 组织样品和培养细胞的裂解 （1）组织样品 ① 将lg新鲜切取的组织在液氮中速冻，并用液氮预冷的研钵研磨。 ② 液氮挥发，将组织粉末一点一点地加入盛有10倍体积裂解液的烧杯中，使其分散于裂解液表面，后振摇烧杯使粉末浸没。 ③ 将悬液转移至50ml三角瓶中，并于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 （2）培养细胞 ①单层培养细胞 i.从孵箱中取出长满单层细胞的培养皿，迅速吸去培养液，用冰冷的TBS洗2次，加入1ml新鲜的冰冷的TBS。 ii. 用橡胶刮棒将细胞刮入1ml TBS中，用吸管将细胞悬液转移到冰上的离心管中。用0.5 ml冰冷的TBS冲洗培养皿，后并入离心管的细胞悬液。 iii.于4℃3000r/min离心10min以收集细胞。 iv. 将细胞重悬于5倍~10倍体积的冰冷TBS中并再度离心。 v. 用1 ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 vi. 每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 ②悬浮培养的细胞 i.将细胞转移至离心管，于4℃3000r/min离心10min以收集细胞，吸去上清。 ii.用1倍体积冰冷的TBS重悬细胞并再度离心，吸去上清，小心地再次重悬细胞于冰冷的TBS中，离心收集细胞。 iii.去上清，用1ml TE（PH8.0）重新悬浮细胞，转移至50 ml三角瓶中。 iv.每毫升细胞悬液加10 ml裂解缓冲液，于37℃温育1h，立即进行步骤1.2.。 2.将裂解液转移至离心管中，裂解液不能超过1/3体积。 3.加入蛋白酶K（20mg/ml）至终浓度100µg/ml。用一灭菌玻璃棒温和地将酶混入细胞裂解液中。 4.将细胞裂解液置于50℃水浴中保温3 h，并不时振摇。 5.将溶液冷却至室温，加入等体积的平衡酚，将离心管置于涡旋器上,使离心管缓慢颠转10min 以温和地混合两相。 6.室温下，6500r/min离心15 min以分离两相。 7.用宽口移液管将黏滞的水相转移至另一离心管。 8.苯酚抽提两次，收集水相。 9.加入0.2倍体积10mol/L醋酸铵及2倍体积无水乙醇，旋转离心管直至溶液彻底混匀为止。 10.DNA随即形成沉淀，在室温下6500r/min离心5 min，收集沉淀。 11.用70%乙醇洗涤DNA沉淀2次，按步骤1.10.离心收集DNA。 12.尽可能吸去残余乙醇,于室温下，将DNA沉淀置于敞开的管内，直至乙醇挥发殆尽。 13.按每0.1m1细胞(步骤1.1)加入1ml TE溶解DNA，将DNA溶液储存于4℃。 14.用紫外分光光度法或二苯胺显色法检测DNA含量。详见本实验第二部分。 |
3楼2010-11-02 17:20:28
5楼2010-11-03 00:02:03
