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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » [size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈，求各位高手近来解答[/size]
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] [size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈，求各位高手近来解答[/size]

我做的是交替氧化酶在大肠杆菌里的表达。实验步骤如下：将RNA反转录成DNA，通过action引物验证没问题，通过特异引物PCR，回收纯化，连接到T载体，成功转化。菌液送测，无问题。提质粒，酶切，回收纯化，连接到酶切纯化后的ｐET28a上。然后转化进BL21中。送测，没问题，用IPTG诱导，可是又到不出来，SDS-PAGE老是无目的带。

     后面又重提T载体质粒开始做，可是做了2次都没有转化BL21成功。对连接产物做凝胶成像符合预期。

     这是肿么了？哪里出问题了？ 打算重头开始做，又找不到问题所在，害怕徒劳无功啊。大家帮忙提建议啦，谢谢。。。。本人小虫，金币不多，还望见谅。

     PS：我的目的片段5‘端有两个ATG，内切酶SacI 和XhoI　，两者相距２１ｂｐ。
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无善无恶心之体
1楼 2012-02-07 10:13:51
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cnliu51

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3): 同勉，我也有这个经历。呵呵 2012-02-09 13:45:47
zhiqiang5070(金币+1): ★有帮助 2012-02-20 15:27:34
这种问题我曾经遇到过，反复构建了两次表达载体，均没有表达出来。经过核实，认为问题出在基因的密码子使用偏好上，后来我们按照大肠菌的密码使用偏好设计了基因，全人工合成了该基因，结果就表达出来了。希望我的经历能给你帮助。
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8楼2012-02-09 10:55:08
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

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zhiqiang5070(金币+2): ★有帮助 2012-02-20 15:26:28
诱导条件有优化过吗？温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。
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2楼2012-02-07 11:30:20
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, 专家考核): 太精辟了 2012-02-08 09:27:13
zhiqiang5070(金币+4): ★★★很有帮助 2012-02-20 15:26:40
连进去了表达不出来的原因也很多的：产物细胞毒性、ORF是否正确、mRNA的结构、密码子偏爱性、诱导条件等。
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3楼2012-02-07 12:54:25
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-02-07 11:30:20:
诱导条件有优化过吗？温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。

各种条件都设了梯度试过了
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无善无恶心之体
4楼2012-02-07 14:20:04
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