应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » [size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈，求各位高手近来解答[/size]
51/1返回列表
查看: 2706  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] [size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈，求各位高手近来解答[/size]

我做的是交替氧化酶在大肠杆菌里的表达。实验步骤如下：将RNA反转录成DNA，通过action引物验证没问题，通过特异引物PCR，回收纯化，连接到T载体，成功转化。菌液送测，无问题。提质粒，酶切，回收纯化，连接到酶切纯化后的ｐET28a上。然后转化进BL21中。送测，没问题，用IPTG诱导，可是又到不出来，SDS-PAGE老是无目的带。

     后面又重提T载体质粒开始做，可是做了2次都没有转化BL21成功。对连接产物做凝胶成像符合预期。

     这是肿么了？哪里出问题了？ 打算重头开始做，又找不到问题所在，害怕徒劳无功啊。大家帮忙提建议啦，谢谢。。。。本人小虫，金币不多，还望见谅。

     PS：我的目的片段5‘端有两个ATG，内切酶SacI 和XhoI　，两者相距２１ｂｐ。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
无善无恶心之体
1楼 2012-02-07 10:13:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, 专家考核): 太精辟了 2012-02-08 09:27:13
zhiqiang5070(金币+4): ★★★很有帮助 2012-02-20 15:26:40
连进去了表达不出来的原因也很多的：产物细胞毒性、ORF是否正确、mRNA的结构、密码子偏爱性、诱导条件等。
赞一下(1人) 回复此楼
3楼2012-02-07 12:54:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+2): ★有帮助 2012-02-20 15:26:28
诱导条件有优化过吗？温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。
赞一下 回复此楼
2楼2012-02-07 11:30:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zhiqiang5070

木虫 (正式写手)
引用回帖:
楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-02-07 11:30:20:
诱导条件有优化过吗？温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。

各种条件都设了梯度试过了
赞一下 回复此楼
无善无恶心之体
4楼2012-02-07 14:20:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

我爱沈泉

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+1): ★有帮助 2012-02-20 15:28:41
俺也在做28a 还没诱导啊 希望结果好啊
赞一下 回复此楼
5楼2012-02-08 08:26:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 如果此刻你正在为国基感到焦虑，不妨来听听这首《基金之外》 +3 scalable 2026-08-24 3/150 2026-08-24 15:02 by arzu_hma
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 我面上完蛋了 +8 且听虎啸 2026-08-20 9/450 2026-08-24 13:52 by zzuzxg
[基金申请] 2026国自然函评费到账 +17 羊腰板 2026-08-21 18/900 2026-08-24 12:03 by iaeyuan
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +12 kulium 2026-08-21 15/750 2026-08-24 12:02 by iaeyuan
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 朋友圈看到的 +7 wangzilk 2026-08-18 9/450 2026-08-24 10:50 by cmrandy
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[基金申请] 今天放榜吗？ +15 布布和一二 2026-08-19 16/800 2026-08-23 09:55 by 张春生
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] 人气不行了 +8 fansofjerry 2026-08-21 8/400 2026-08-22 16:30 by zyqchem
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +8 chengyan1220 2026-08-21 11/550 2026-08-21 17:52 by dcqxinyang
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭