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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

[求助] [size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈,求各位高手近来解答[/size]

我做的是交替氧化酶在大肠杆菌里的表达。实验步骤如下:将RNA反转录成DNA,通过action引物验证没问题,通过特异引物PCR,回收纯化,连接到T载体,成功转化。菌液送测,无问题。提质粒,酶切,回收纯化,连接到酶切纯化后的pET28a上。然后转化进BL21中。送测,没问题,用IPTG诱导,可是又到不出来,SDS-PAGE老是无目的带。

     后面又重提T载体质粒开始做,可是做了2次都没有转化BL21成功。对连接产物做凝胶成像符合预期。

     这是肿么了?哪里出问题了? 打算重头开始做,又找不到问题所在,害怕徒劳无功啊。大家帮忙提建议啦,谢谢。。。。本人小虫,金币不多,还望见谅。

     PS:我的目的片段5‘端有两个ATG,内切酶SacI 和XhoI ,两者相距21bp。
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无善无恶心之体
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zhiqiang5070

木虫 (正式写手)

引用回帖:
: Originally posted by 西瓜 at 2012-02-07 11:30:20:
诱导条件有优化过吗?温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。

各种条件都设了梯度试过了
无善无恶心之体
4楼2012-02-07 14:20:04
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查看全部 14 个回答

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+2): 有帮助 2012-02-20 15:26:28
诱导条件有优化过吗?温度、时间、IPTG浓度都可以调整的。
2楼2012-02-07 11:30:20
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木(金币+3, 专家考核): 太精辟了 2012-02-08 09:27:13
zhiqiang5070(金币+4): ★★★很有帮助 2012-02-20 15:26:40
连进去了表达不出来的原因也很多的:产物细胞毒性、ORF是否正确、mRNA的结构、密码子偏爱性、诱导条件等。
3楼2012-02-07 12:54:25
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我爱沈泉

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
zhiqiang5070(金币+1): 有帮助 2012-02-20 15:28:41
俺也在做28a 还没诱导啊 希望结果好啊
5楼2012-02-08 08:26:58
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