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zhiqiang5070木虫 (正式写手)
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[求助]
[size=5]外源基因原核表达遭遇种种瓶颈，求各位高手近来解答[/size]
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我做的是交替氧化酶在大肠杆菌里的表达。实验步骤如下：将RNA反转录成DNA，通过action引物验证没问题，通过特异引物PCR，回收纯化，连接到T载体，成功转化。菌液送测，无问题。提质粒，酶切，回收纯化，连接到酶切纯化后的ｐET28a上。然后转化进BL21中。送测，没问题，用IPTG诱导，可是又到不出来，SDS-PAGE老是无目的带。 后面又重提T载体质粒开始做，可是做了2次都没有转化BL21成功。对连接产物做凝胶成像符合预期。 这是肿么了？哪里出问题了？ 打算重头开始做，又找不到问题所在，害怕徒劳无功啊。大家帮忙提建议啦，谢谢。。。。本人小虫，金币不多，还望见谅。 PS：我的目的片段5‘端有两个ATG，内切酶SacI 和XhoI ，两者相距２１ｂｐ。 |
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