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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » WB电泳时，蛋白样品堵在上样口
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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)

[求助] WB电泳时，蛋白样品堵在上样口 已有1人参与

提取的是细胞蛋白，贴壁细胞，10^7个细胞，用200微升RIPA（强）裂解液，冰上裂解30-45min，离心取上清，加buffer 100度煮10分钟，上样电泳，然后就遇到问题了，样品有一部分堵在上样孔，一部分先跑下去，然后形成拖尾，一直在想办法都没解决，有没有哪位也遇到过，或者帮帮忙看看是哪出了问题？
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1楼 2012-02-04 17:34:25
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1, 专家考核): 有可能 2012-02-04 21:12:43
煮完楼主没离心？很有可能是没溶解好
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jiayoubashaonian
2楼2012-02-04 20:41:20
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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-04 20:41:20:
煮完楼主没离心？很有可能是没溶解好

离心了
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3楼2012-02-04 23:51:17
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)
稀释
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4楼2012-02-05 07:58:47
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-02-05 12:20:52
个人觉得是你的裂解液制备有问题！你再看看吧！
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每天坚持多一点，以后困难少一点！
5楼2012-02-05 08:56:27
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cangyiliuyun at 2012-02-04 23:51:17:
离心了

是不是样品的溶解没完全？
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jiayoubashaonian
6楼2012-02-05 10:00:02
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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
楼: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-04 20:41:20:
煮完楼主没离心？很有可能是没溶解好

要是没溶解好怎么把，换buffer还是裂解液？buffer我新配一些还是这个问题，是不是buffer盐离子浓度低了，会这样？
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7楼2012-02-05 11:49:24
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 专业！ 2012-02-05 12:20:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by cangyiliuyun at 2012-02-05 11:49:24:
要是没溶解好怎么把，换buffer还是裂解液？buffer我新配一些还是这个问题，是不是buffer盐离子浓度低了，会这样？

楼主能不能将裂解的样品量适当减少一些，延长裂解时间，还有上样量是否可以减少一些？我们之前也碰到这样的问题，后来花了一个多月的时间，根据已经发表的文章，来优化样品提取，裂解，上样，现在的体系已经很稳定了，每次的重复挺好的。
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jiayoubashaonian
8楼2012-02-05 12:08:42
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
估计是你缓冲液或胶配制的问题
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9楼2012-02-06 18:36:44
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freshblack

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
样品浓度降低，煮的时间可以适当延长呀~
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勤有功，戏无益，满招损，谦得益
10楼2012-02-07 14:21:21
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