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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)

[求助] WB电泳时,蛋白样品堵在上样口 已有1人参与

提取的是细胞蛋白,贴壁细胞,10^7个细胞,用200微升RIPA(强)裂解液,冰上裂解30-45min,离心取上清,加buffer 100度煮10分钟,上样电泳,然后就遇到问题了,样品有一部分堵在上样孔,一部分先跑下去,然后形成拖尾,一直在想办法都没解决,有没有哪位也遇到过,或者帮帮忙看看是哪出了问题?
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1, 专家考核): 有可能 2012-02-04 21:12:43
煮完楼主没离心?很有可能是没溶解好
jiayoubashaonian
2楼2012-02-04 20:41:20
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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-04 20:41:20:
煮完楼主没离心?很有可能是没溶解好

离心了
3楼2012-02-04 23:51:17
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lzgxgz

至尊木虫 (正式写手)

4楼2012-02-05 07:58:47
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0624410024

金虫 (正式写手)

Begging for knowledge

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
西瓜(金币+1): 鼓励应助 2012-02-05 12:20:52
个人觉得是你的裂解液制备有问题!你再看看吧!
每天坚持多一点,以后困难少一点!
5楼2012-02-05 08:56:27
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by cangyiliuyun at 2012-02-04 23:51:17:
离心了

是不是样品的溶解没完全?
jiayoubashaonian
6楼2012-02-05 10:00:02
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cangyiliuyun

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
: Originally posted by blackrose8089 at 2012-02-04 20:41:20:
煮完楼主没离心?很有可能是没溶解好

要是没溶解好怎么把,换buffer还是裂解液?buffer我新配一些还是这个问题,是不是buffer盐离子浓度低了,会这样?
7楼2012-02-05 11:49:24
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
西瓜(金币+4): 专业! 2012-02-05 12:20:36
引用回帖:
7楼: Originally posted by cangyiliuyun at 2012-02-05 11:49:24:
要是没溶解好怎么把,换buffer还是裂解液?buffer我新配一些还是这个问题,是不是buffer盐离子浓度低了,会这样?

楼主能不能将裂解的样品量适当减少一些,延长裂解时间,还有上样量是否可以减少一些?我们之前也碰到这样的问题,后来花了一个多月的时间,根据已经发表的文章,来优化样品提取,裂解,上样,现在的体系已经很稳定了,每次的重复挺好的。
jiayoubashaonian
8楼2012-02-05 12:08:42
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c3024034

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
估计是你缓冲液或胶配制的问题
9楼2012-02-06 18:36:44
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freshblack

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
样品浓度降低,煮的时间可以适当延长呀~
勤有功,戏无益,满招损,谦得益
10楼2012-02-07 14:21:21
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