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smallland至尊木虫 (著名写手)
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求助硫酸铵沉淀蛋白质的问题
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用硫酸铵沉淀水溶液中的蛋白质的实验。如果硫酸铵未用H2S预处理，会对蛋白沉淀实验造成什么影响？ 书上说硫酸铵中可能有重金属元素，而重金属会对蛋白质的巯基很敏感。问题是“敏感”是什么影响？是让蛋白质变性？还是别的什么？希望行家解答。谢谢！ |
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【答案】应助回帖
smallland(金币+7): 谢谢您的耐心帮助！ 2011-11-09 23:00:50
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因为所用的是饱和硫酸铵(加热后，还有固体硫酸铵沉淀为止）,加入EDTA络合金属离子后，就回沉淀到容器的底部，并不影响上面溶液的使用。 补充一点：所用的饱和硫酸铵溶液一定要调PH值，原则上要比纯化蛋白的等电点稍高。（个人建议，可调PH=8.2 进行，不合适再作调整，特殊蛋白除外） 回答4楼：低速离心如楼上所说，3000--5000都可以，5min。以不超过8000转为宜！ 不太同意硫酸铵固体，原因： 1）固体加入不方便 2）硫酸铵固体可能还有一直讨论的重金属离子 3）PH值不宜调整 4）固体加入容易引起局部浓度过高，影响沉淀的形成。 回答如有不妥之处，还请共同学习！ |
7楼2011-11-09 10:40:31
txyamy
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2楼2011-11-08 08:26:34
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【答案】应助回帖
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看天(金币+3, BioEPI+1): 不错 2011-11-08 09:15:55
smallland(金币+9): 谢谢！请问EDTA络合重金属后再如何处理？ 2011-11-08 17:05:53
看天(金币+3, BioEPI+1): 不错 2011-11-08 09:15:55
smallland(金币+9): 谢谢！请问EDTA络合重金属后再如何处理？ 2011-11-08 17:05:53
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因为蛋白中含有二硫键(如胱氨酸），在重金属离子的存在下，可以二硫键，导致蛋白结构破坏。 所说“敏感”是应为，金属离子在微量（甚至痕量）状态向，就可以破坏蛋白结构！ 正如二楼所说，加入适量EDTA即可络合金属离子！ 刚开始加入饱和硫酸铵时，切记速度不能过快，以防影响蛋白水化膜的剥落！ 做透析时，透析袋也需要EDTA处理，原因同上！ 透析过后的蛋白如有变性（即少许沉淀产生），可用低速离心去除！ 祝君顺利，早日成功！ 如有不妥地方，还请高人指正！ |
3楼2011-11-08 08:59:49
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4楼2011-11-08 09:23:15
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