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oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] BAC文库连接转化

请问一下，做BAC文库构建时，为什么大片段超过100K的总是连不上去呢，转化后经NotI酶切检测，片段大小都在30k左右，按照说明书上的步骤进行的连接，可是为什么大片段总是连不上呢？求各位帮忙！！！！谢谢
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1楼 2011-10-26 22:47:34
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:21
不知你的目的片段是否大小差不多，要是混在一起连接肯定小片段占优势，另外可以尝试连接时间延长，中间补加几次连接酶
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2011-11-03 11:55:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:17
你的片段怎么制备的？为何30kb-100kb差这么多？可以试试用PCR仪不同温度交替这样连接。可以查查 赵茂林 的文章，他们课题组做过几个类似的项目，也发表了一些方法学文章，希望对你有帮助。
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The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-11-03 13:36:58
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oceanworld

木虫 (小有名气)
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？
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4楼2011-11-04 10:34:08
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by oceanworld at 2011-11-04 10:34:08:
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？

你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。
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5楼2011-11-04 11:26:37
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oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-04 11:26:37:
你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。

我是利用普通电泳透析袋的方法回收的!回收后检测过浓度，约3ng/ul！
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6楼2011-11-05 08:50:32
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brightfuture01

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【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 17:15:08
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接上，所以你连进去的全是小片段。
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7楼2011-11-05 12:30:14
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oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 12:30:14:
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接 ...

您好，非常感谢您的解答！您的意思是在电洗脱回收DNA的过程中应该用脉冲电泳回收而不是在普通凝胶电泳上回收是吗？可是我看到的文献上这样写的“将透析袋浸泡于装有0.5 × TBE缓冲液的水平电泳槽中，用载玻片压住透析袋夹防止透析过程中透析袋的移动，同时使胶块的长度方向和电极平行，使电流透过透析袋，用4.5v/cm的电场强度于4℃洗脱3h；”请问这样做真的不行吗？
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8楼2011-11-05 17:26:26
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

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【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 22:25:20
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。
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9楼2011-11-05 20:56:02
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liuzhan2705

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 20:56:02:
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。

您好！想向您请教一下脉冲场电泳的问题，我现在在做脉冲场电泳，可是自己做的胶块每次都切不开？条带要么在孔里，要么整个通道都是拖尾现象~请问这是怎么回事？在制作过程中有什么特别注意事项吗、？不胜感激~
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10楼2011-12-19 20:05:37
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