应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BAC文库连接转化
231/3返回列表123下一页
查看: 2189  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] BAC文库连接转化

请问一下，做BAC文库构建时，为什么大片段超过100K的总是连不上去呢，转化后经NotI酶切检测，片段大小都在30k左右，按照说明书上的步骤进行的连接，可是为什么大片段总是连不上呢？求各位帮忙！！！！谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-26 22:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:21
不知你的目的片段是否大小差不多，要是混在一起连接肯定小片段占优势，另外可以尝试连接时间延长，中间补加几次连接酶
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2011-11-03 11:55:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:17
你的片段怎么制备的？为何30kb-100kb差这么多？可以试试用PCR仪不同温度交替这样连接。可以查查 赵茂林 的文章，他们课题组做过几个类似的项目，也发表了一些方法学文章，希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-11-03 13:36:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-04 10:34:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by oceanworld at 2011-11-04 10:34:08:
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？

你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2011-11-04 11:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-04 11:26:37:
你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。

我是利用普通电泳透析袋的方法回收的!回收后检测过浓度，约3ng/ul！
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-05 08:50:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 17:15:08
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接上，所以你连进去的全是小片段。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2011-11-05 12:30:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 12:30:14:
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接 ...

您好，非常感谢您的解答！您的意思是在电洗脱回收DNA的过程中应该用脉冲电泳回收而不是在普通凝胶电泳上回收是吗？可是我看到的文献上这样写的“将透析袋浸泡于装有0.5 × TBE缓冲液的水平电泳槽中，用载玻片压住透析袋夹防止透析过程中透析袋的移动，同时使胶块的长度方向和电极平行，使电流透过透析袋，用4.5v/cm的电场强度于4℃洗脱3h；”请问这样做真的不行吗？
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-05 17:26:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 22:25:20
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2011-11-05 20:56:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuzhan2705

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 20:56:02:
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。

您好！想向您请教一下脉冲场电泳的问题，我现在在做脉冲场电泳，可是自己做的胶块每次都切不开？条带要么在孔里，要么整个通道都是拖尾现象~请问这是怎么回事？在制作过程中有什么特别注意事项吗、？不胜感激~
赞一下 回复此楼
10楼2011-12-19 20:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 oceanworld 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +5 雨打竹帘 2026-08-30 9/450 2026-08-30 22:23 by 余韵清
[考博] 找导师 +6 yuanjiabao 2026-08-29 7/350 2026-08-30 14:40 by 生科新手
[基金申请] 29号明天会评吗 +3 笨笨唐 2026-08-28 3/150 2026-08-30 09:29 by cww8181
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见（F口面上） +6 gdd2018 2026-08-28 11/550 2026-08-30 08:58 by 超级无敌华子
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 国自然评审意见 +13 wangmingqi 2026-08-28 19/950 2026-08-29 10:22 by Poppy1104
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 基金未中，这种答复是模板吗？ +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[基金申请] 我不理解！ +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合现在查不到了吗？ +10 chengyan1220 2026-08-24 20/1000 2026-08-26 08:57 by peasantsprig
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭