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汕头大学海洋科学接受调剂
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oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] BAC文库连接转化

请问一下,做BAC文库构建时,为什么大片段超过100K的总是连不上去呢,转化后经NotI酶切检测,片段大小都在30k左右,按照说明书上的步骤进行的连接,可是为什么大片段总是连不上呢?求各位帮忙!!!!谢谢
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 22:25:20
不是回收的问题,是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段,而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行,脉冲场电泳有制冷系统,可以让buffer保持在一个恒定的低温。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2011-11-05 20:56:02
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jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:21
不知你的目的片段是否大小差不多,要是混在一起连接肯定小片段占优势,另外可以尝试连接时间延长,中间补加几次连接酶
人生百态原为海,看破红尘方为岸!
2楼2011-11-03 11:55:05
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:17
你的片段怎么制备的?为何30kb-100kb差这么多?可以试试用PCR仪不同温度交替这样连接。可以查查 赵茂林 的文章,他们课题组做过几个类似的项目,也发表了一些方法学文章,希望对你有帮助。
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-11-03 13:36:58
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oceanworld

木虫 (小有名气)

我割胶的时候割的是100-150kb的片段,可是连上去的却是30kb左右,连接过夜也不行啊?不知道是哪一步出问题了?
4楼2011-11-04 10:34:08
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