应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BAC文库连接转化
231/3返回列表123下一页
查看: 2214  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] BAC文库连接转化

请问一下，做BAC文库构建时，为什么大片段超过100K的总是连不上去呢，转化后经NotI酶切检测，片段大小都在30k左右，按照说明书上的步骤进行的连接，可是为什么大片段总是连不上呢？求各位帮忙！！！！谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-26 22:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:21
不知你的目的片段是否大小差不多，要是混在一起连接肯定小片段占优势，另外可以尝试连接时间延长，中间补加几次连接酶
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2011-11-03 11:55:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:17
你的片段怎么制备的？为何30kb-100kb差这么多？可以试试用PCR仪不同温度交替这样连接。可以查查 赵茂林 的文章，他们课题组做过几个类似的项目，也发表了一些方法学文章，希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-11-03 13:36:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-04 10:34:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by oceanworld at 2011-11-04 10:34:08:
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？

你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2011-11-04 11:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-04 11:26:37:
你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。

我是利用普通电泳透析袋的方法回收的!回收后检测过浓度，约3ng/ul！
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-05 08:50:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 17:15:08
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接上，所以你连进去的全是小片段。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2011-11-05 12:30:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 12:30:14:
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接 ...

您好，非常感谢您的解答！您的意思是在电洗脱回收DNA的过程中应该用脉冲电泳回收而不是在普通凝胶电泳上回收是吗？可是我看到的文献上这样写的“将透析袋浸泡于装有0.5 × TBE缓冲液的水平电泳槽中，用载玻片压住透析袋夹防止透析过程中透析袋的移动，同时使胶块的长度方向和电极平行，使电流透过透析袋，用4.5v/cm的电场强度于4℃洗脱3h；”请问这样做真的不行吗？
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-05 17:26:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 22:25:20
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2011-11-05 20:56:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuzhan2705

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 20:56:02:
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。

您好！想向您请教一下脉冲场电泳的问题，我现在在做脉冲场电泳，可是自己做的胶块每次都切不开？条带要么在孔里，要么整个通道都是拖尾现象~请问这是怎么回事？在制作过程中有什么特别注意事项吗、？不胜感激~
赞一下 回复此楼
10楼2011-12-19 20:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 oceanworld 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 5/250 2026-09-14 16:25 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:13 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 4/200 2026-09-14 16:12 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:57 by Aj1rhIDL5ixY
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:48 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:45 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:37 by Aj1rhIDL5ixY
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +5 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:21 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:13 by Aj1rhIDL5ixY
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 15:09 by Aj1rhIDL5ixY
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 15:01 by Aj1rhIDL5ixY
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 6/300 2026-09-14 15:00 by Aj1rhIDL5ixY
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 3/150 2026-09-14 14:57 by Aj1rhIDL5ixY
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 3/150 2026-09-14 12:35 by 40ms4Wlo4umh
[基金申请] 求教各位大神：2026教育部人文社科青年基金项目何时公示呀？ +5 云宴山人 2026-09-10 7/350 2026-09-14 12:11 by ecnu2013
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 4/200 2026-09-14 10:01 by 23jxep3nCNZb
[考博] 西北工业大学材料学院电化学传感与催化课题组招收2027年推免研究生、博士生、博士后 +3 马方园 2026-09-10 4/200 2026-09-14 09:29 by Chem张zz
[考博] 27秋季材料博士申请求助 10+3 Cahal1 2026-09-11 4/200 2026-09-14 08:50 by 北京莱茵编辑
[教师之家] 浙江师范大学是怎么坑我的 +10 recruit123 2026-09-09 15/750 2026-09-13 10:45 by seaskyy
[有机交流] 科研求助 10+4 我吃一只鱼 2026-09-07 4/200 2026-09-10 08:32 by 0940628
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭