应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » BAC文库连接转化
231/3返回列表123下一页
查看: 2165  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

oceanworld

木虫 (小有名气)

[求助] BAC文库连接转化

请问一下，做BAC文库构建时，为什么大片段超过100K的总是连不上去呢，转化后经NotI酶切检测，片段大小都在30k左右，按照说明书上的步骤进行的连接，可是为什么大片段总是连不上呢？求各位帮忙！！！！谢谢
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-26 22:47:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:21
不知你的目的片段是否大小差不多，要是混在一起连接肯定小片段占优势，另外可以尝试连接时间延长，中间补加几次连接酶
赞一下 回复此楼
人生百态原为海，看破红尘方为岸！
2楼2011-11-03 11:55:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-04 10:34:17
你的片段怎么制备的？为何30kb-100kb差这么多？可以试试用PCR仪不同温度交替这样连接。可以查查 赵茂林 的文章，他们课题组做过几个类似的项目，也发表了一些方法学文章，希望对你有帮助。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
3楼2011-11-03 13:36:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？
赞一下 回复此楼
4楼2011-11-04 10:34:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by oceanworld at 2011-11-04 10:34:08:
我割胶的时候割的是100-150kb的片段，可是连上去的却是30kb左右，连接过夜也不行啊？不知道是哪一步出问题了？

你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
5楼2011-11-04 11:26:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-04 11:26:37:
你用胶回收的办法获取的100kb的片段？ 不知道你是用试剂盒回收的还是类似脉冲场电泳透析袋方法回收的，还是用凝胶酶酶解凝胶后回收的。。。

你在回帖的时候可以引用我的回帖，这样便于我看到后跟进。

我是利用普通电泳透析袋的方法回收的!回收后检测过浓度，约3ng/ul！
赞一下 回复此楼
6楼2011-11-05 08:50:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 17:15:08
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接上，所以你连进去的全是小片段。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
7楼2011-11-05 12:30:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

oceanworld

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 12:30:14:
看样子你是在普通凝胶电泳上分离的30-150kb的DNA了，不知道你看过些什么文献是这样做的。普通的凝胶电泳分不开的，所以你回收的DNA里面含有大量的小片段，这些小片段在连接的时候需要的能量少，能优先连接 ...

您好，非常感谢您的解答！您的意思是在电洗脱回收DNA的过程中应该用脉冲电泳回收而不是在普通凝胶电泳上回收是吗？可是我看到的文献上这样写的“将透析袋浸泡于装有0.5 × TBE缓冲液的水平电泳槽中，用载玻片压住透析袋夹防止透析过程中透析袋的移动，同时使胶块的长度方向和电极平行，使电流透过透析袋，用4.5v/cm的电场强度于4℃洗脱3h；”请问这样做真的不行吗？
赞一下 回复此楼
8楼2011-11-05 17:26:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

我爱打老虎

文献杰出贡献

【答案】应助回帖

oceanworld(金币+2): 2011-11-05 22:25:20
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。
赞一下 回复此楼
The world is a fine place and worth fighting for. I agree with the second part.
9楼2011-11-05 20:56:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

liuzhan2705

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by brightfuture01 at 2011-11-05 20:56:02:
不是回收的问题，是分离的问题。平常的凝胶电泳区分不开30-150kb的片段，而脉冲场凝胶电泳可以分开。电洗脱回收最好也能在低温下进行，脉冲场电泳有制冷系统，可以让buffer保持在一个恒定的低温。

您好！想向您请教一下脉冲场电泳的问题，我现在在做脉冲场电泳，可是自己做的胶块每次都切不开？条带要么在孔里，要么整个通道都是拖尾现象~请问这是怎么回事？在制作过程中有什么特别注意事项吗、？不胜感激~
赞一下 回复此楼
10楼2011-12-19 20:05:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 oceanworld 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +16 koalala 2026-08-24 18/900 2026-08-24 15:43 by zhuzg0628
[基金申请] 今日不放榜？网传国自然预计 8 月 27 日可查结果 +17 医学老男孩 2026-08-20 21/1050 2026-08-24 14:21 by refreshing11
[基金申请] 估计是周四 +4 archvillain 2026-08-18 4/200 2026-08-24 13:53 by zzuzxg
[基金申请] 我面上完蛋了 +8 且听虎啸 2026-08-20 9/450 2026-08-24 13:52 by zzuzxg
[基金申请] 范进中举一文的中心思想 +6 炎黄贵胄 2026-08-22 7/350 2026-08-24 11:58 by 6543yes
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +13 大萍1987 2026-08-20 16/800 2026-08-24 10:23 by 太傻了
[基金申请] 放榜前的不淡定 20+4 snowwithsea 2026-08-19 17/850 2026-08-24 10:20 by echo8914667
[基金申请] 明天应该可查了！？ +4 chengyan1220 2026-08-23 4/200 2026-08-24 08:47 by gloomy6159
[基金申请] 什么时候开奖？ +10 CrisMessi 2026-08-18 11/550 2026-08-24 06:50 by 开心的小狮子
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +4 process2012 2026-08-23 5/250 2026-08-23 19:58 by jurkat.1640
[教师之家] 跳槽后在研项目怎么办？ +5 简单化xn 2026-08-22 10/500 2026-08-23 12:38 by 简单化xn
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +7 且听虎啸 2026-08-17 8/400 2026-08-22 21:55 by 医学老男孩
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +24 yaoyewhu2008 2026-08-20 26/1300 2026-08-22 17:43 by kammury
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +13 ziyangfang 2026-08-19 16/800 2026-08-22 17:08 by WH3796
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +16 kkkl_v 2026-08-19 17/850 2026-08-22 16:12 by 阿布Abu
[基金申请] 时间戳今天，20号变了 +5 archvillain 2026-08-20 5/250 2026-08-22 06:12 by hui_daxiao
[基金申请] 时间戳又变了 +13 wuchongjun 2026-08-20 19/950 2026-08-21 17:21 by 紫杉醇
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 基金啊基金 +4 longfie172 2026-08-20 4/200 2026-08-21 08:58 by mark mao
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭