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hqc87

铁虫 (小有名气)

[求助] RT-PCR actin内参问题

做了两次逆转录,合成cDNA后以actin做内参,8个样品actin表达量竟然不一样啊!!??两次(一次用500ngRNA,一次用2ug)都是同一个模式,电泳条带强的样品仍旧强,弱的仍旧弱,而且,我在合成cDNA前 用DNase处理RNA后特意跑了下胶,检测RNA完整性,8个样品RNA质量都没问题,但是合成cDNA后,扩actin怎么强度不一样呢,而且两次重复模式一样,不应该啊,困惑啊,求解!!
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snzydong

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


lstt09nk(金币+1): 鼓励交流 2011-08-19 18:05:23
hqc87(金币+2): 反转录成cDNA后,用cDNA做模板做PCR,actin和其他基因分管做,不在同一管 2011-08-19 22:07:04
你是反转和表达在一管完成么
有可能你反转录不彻底 获得的cDNA量就不一样
当然actin也确实不是很稳定的内标基因在某些植物中
你可以查查别人的文章 有很多关于内标基因筛选的文章
3楼2011-08-19 12:47:08
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kgz163

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢交流 2011-08-19 18:05:03
hqc87(金币+2): 谢谢! 2011-08-19 22:05:21
你可以多设计几个内参。对于不同植物、不同材料,适合的内参是不一样的。

有文章表明,在水稻里,actin不是最好的内参,表现算是中等偏好。

我们前一段用18S做内参,表达差异也非常大
2楼2011-08-19 11:44:49
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