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bear0329金虫 (正式写手)
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[求助]
真菌ITS序列PCR扩增 求助
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提取到土壤DNA后进行真菌ITS序列PCR扩增，用的引物是ITS1F/ITS4R 做了温度梯度PCR，退火温度从45℃——65℃，检测结果显示，非特异性条带多，目的产物产量不高，见下图 该如何优化PCR体系和程序？请各位虫友提供宝贵意见，先谢谢啦！ PCR体系： 总体积 30 10×buffer 3 dNTP 1.5 引物 1 taq EX 0.3 BSA 0.2 模板 1 水 22 程序： 94℃ 4min 94℃ 1min 45℃~65℃ 45s 72℃ 90s 72℃ 10min 32个循环  |
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 土壤真菌 | 【分子生物】EPI帖 |
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【答案】应助回帖
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西瓜(金币+5, EPI+1): 厉害厉害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金币+2): 谢谢你的建议啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:32
西瓜(金币+5, EPI+1): 厉害厉害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金币+2): 谢谢你的建议啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:32
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被我猜中了，你发帖的时候我就在想你的意图，现在果然没猜错。 由于你的序列长度相差可能不大，跑电泳极难分得开，所以不能回收。再说了，即使是分得很开，也存在两个菌株的扩增产物长度完全相同的隐患，所以是得不到单一产物的。 但是你可以将扩增产物都回收（保持产物的多样性才能达到你分析多样性的目的），全部与载体连接，得到一批含有外源片段的克隆子，转化载体到宿主内（一般选用大肠杆菌），涂板得到单菌落，这就是可能含有各不相同的ITS序列的克隆子了，将这些克隆子分别培养提取质粒送测序，就能得到很多菌株的ITS序列，进行多样性分析了。 当然这会耗费一笔钱，但这是必须付出的代价。 |
6楼2011-07-04 23:20:18
beautybanana
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金币+2): 我是做多态性分析的，不是做鉴定，里面应该有很多的ITS序列，谢谢啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:16
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金币+2): 我是做多态性分析的，不是做鉴定，里面应该有很多的ITS序列，谢谢啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:16
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你是不是要做菌种的ITS序列的鉴定呢？如果是的话，我把我做过的告诉你，如果不是的就算了哇~ ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’ PCR Amplification reaction system（50μl） ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2 5.0μl dNTPs(2.5mM) 1.0μl Primer5’ 2.0μl Primer3’ 2.0μl DNA template 1.0μl Taq DNA ploymerase(5U/μl) 0.5μl 反应程序如下： 94℃ for 5 minutes denaturalization 94℃ for 45 seconds denaturation 52℃ for 45 seconds annealing 72℃ for 1min30sec extension 2 35 72℃ for 10 minutes final extension 大概500bp左右 |
3楼2011-07-04 16:17:18
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西瓜(金币+5): 鼓励 2011-07-05 00:31:55
西瓜(金币+5): 鼓励 2011-07-05 00:31:55
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楼主提取土壤样品的DNA，里面的微生物是非常丰富的，当然也是含有多种真菌的，使用真菌通用引物来扩增，照理说应该得到多个扩增产物，他们的ITS的长度相互之间不会变化太大，所以跑DNA电泳的时候可能会在相近的地方有多条带。（现在论坛不能上传和下载文件，连带着看不到楼主贴出来的图。）所以不存在非特异性扩增的说法。理应是多条带的，只得到一条带才奇怪，无论是做什么退火温度梯度，结果都不会有实质性改变。 你的PCR体系总体积是29微升，引物只有1微升，是不是想写正反向引物各1微升？体系和我用的一样，程序也没有任何问题，除了退火温度之外，其余的和我的一样。 beautybanana用的是ITS5，其实也没问题，大同小异。ITS1和5都是在18S上的，ITS4在28S上，ITS1和4或者5和4都可以用，扩增得到的可变区都是完整的两个。至于长度就难说了，各种不同种属的真菌得到的长度可能会不同，不局限于500bp。 |
4楼2011-07-04 19:06:39
bear0329
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