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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 真菌ITS序列PCR扩增 求助
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beautybanana

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, EPI+1): 2011-07-04 18:03:59
bear0329(金币+2): 我是做多态性分析的，不是做鉴定，里面应该有很多的ITS序列，谢谢啊 2011-07-04 22:01:24
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:16
你是不是要做菌种的ITS序列的鉴定呢？如果是的话，我把我做过的告诉你，如果不是的就算了哇~
ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’
ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’
PCR Amplification reaction system（50μl）
ddH2O                        38.5μl
10×buffer with MgCl2        5.0μl
dNTPs(2.5mM)        1.0μl
Primer5’                        2.0μl
Primer3’                        2.0μl
DNA template        1.0μl
Taq DNA ploymerase(5U/μl)        0.5μl

反应程序如下：
94℃  for   5 minutes   denaturalization
94℃  for  45 seconds   denaturation
52℃  for  45 seconds   annealing
72℃  for   1min30sec   extension  2  35
72℃  for  10 minutes  final extension
大概500bp左右
赞一下(4人) 回复此楼
3楼2011-07-04 16:17:18
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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): 厉害厉害！ 2011-07-05 00:31:39
bear0329(金币+2): 谢谢你的建议啊~ 2011-07-05 07:57:12
bear0329(金币+1): 2011-07-06 15:13:32
被我猜中了，你发帖的时候我就在想你的意图，现在果然没猜错。

由于你的序列长度相差可能不大，跑电泳极难分得开，所以不能回收。再说了，即使是分得很开，也存在两个菌株的扩增产物长度完全相同的隐患，所以是得不到单一产物的。

但是你可以将扩增产物都回收（保持产物的多样性才能达到你分析多样性的目的），全部与载体连接，得到一批含有外源片段的克隆子，转化载体到宿主内（一般选用大肠杆菌），涂板得到单菌落，这就是可能含有各不相同的ITS序列的克隆子了，将这些克隆子分别培养提取质粒送测序，就能得到很多菌株的ITS序列，进行多样性分析了。

当然这会耗费一笔钱，但这是必须付出的代价。
赞一下(2人) 回复此楼
流星来时我许了个愿，愿我有吃有喝还有舒服的猪圈。讨厌发帖前不搜索论坛重复发帖和仅把论坛当解决问题工具，久不看论坛一来就提问者，宁弃EPI和VIP也不回帖。
6楼2011-07-04 23:20:18
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