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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酵母质粒转化及提取验证问题求助
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 酵母质粒转化及提取验证问题求助

最近需将穿梭质粒转入啤酒酵母W303内，用化学法（醋酸锂）转化，URA选择性平板培养数日后终于出现阳性菌落。为了鉴定阳性转化子是否转入质粒，我挑了阳性菌落，用酵母质粒抽提试剂盒提取了质粒，用这个质粒转入DH5alfa（50ul感受态细胞，5ul质粒），但平板上没有阳性菌落。随后又重复转DH5alfa（100ul感受态细胞，10ul质粒），仍无阳性转化子。现在不知道该怎么办了，求助各位~
现在问题很多，很乱：
1，转DH5a失败原因可能在转化操作，也可能是质粒的问题。因为之前老外邮寄过来的质粒就是先在DH5a里扩增的，因此前者可排除。所以就是质粒出了问题。
2，质粒的问题有二：要么根本没转进酵母，要么试剂盒没提出质粒。
3，要想验证问题2，是应该做PCR验证还是直接将酵母里提出的质粒测序？
4，酵母质粒抽提时候，摇菌条件对质粒影响大吗？试剂盒说明上说过度培养会使ＤＮＡ降解；坛子里有虫子说要酵母菌液１０ｍｌ，那最后洗脱使用洗脱剂体积多少合适？

先谢过各位了～
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1楼 2011-05-26 15:17:31
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
没有做酵母的虫子吗
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2楼2011-05-26 20:09:54
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普通回帖

baby1_9253344

金虫 (小有名气)
3楼2011-05-27 10:12:41
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

baby1_9253344(金币+2): 2011-05-27 15:57:11
额。。感觉上咋跟我理解的不一样呢。。穿梭质粒是在DH5a中扩增的，您的质粒是应该线性化后再转入酵母菌中进行同源重组吧。。。筛选的应该是拷贝数较高的菌株！没太明白如何从酵母菌中提取转染进的线性质粒？可能是我孤陋了。。据我所知是无法从已经转染过后的酵母菌种提取质粒的吧。。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-27 14:57:56
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by deblway at 2011-05-27 14:57:56:
额。。感觉上咋跟我理解的不一样呢。。穿梭质粒是在DH5a中扩增的，您的质粒是应该线性化后再转入酵母菌中进行同源重组吧。。。筛选的应该是拷贝数较高的菌株！没太明白如何从酵母菌中提取转染进的线性质粒？可能是 ...

您的意思是质粒在酵母中线性化就不能再提出来了吗？试剂公司有卖酵母质粒提取试剂盒的，我就是用那个试剂盒提取的...
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5楼2011-05-27 15:58:46
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

线性化的质粒同源重组到酵母基因组当中滴。。你确定下你的是酵母基因组DNA提取试剂盒还是酵母质粒提取试剂盒。。。我真的是头一次听说转染后的酵母是可以提出转染质粒的！如果真的可以还用穿梭载体干嘛！？表示怀疑捏。。。
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海贼王！哥当定了。。。。
6楼2011-05-27 20:55:22
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫

【答案】应助回帖

baby1_9253344(金币+2): 3Q 2011-05-28 19:20:33
你用一个原来转进酵母的质粒作对照转DH5a，就可以知道你的问题是感受态的问题还是酵母提取质粒试剂盒的问题。
你还可以通过PCR来验证你是否提取酵母质粒成功。如果以你提取的酵母质粒PCR都没条带，那么几乎可以肯定你没有提取到~
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仕不可不弘毅，任重而道远
7楼2011-05-28 13:22:27
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

baby1_9253344(金币+1): 3Q 2011-05-28 19:20:58
（化学法）转化酿酒酵母，提取酵母质粒，都有试剂盒卖的。。
而且酵母可以菌落PCR，不必提取质粒验证了。

你的情况最可能是酵母转化出来的是假阳性，clontech有这个缺陷培养基卖的。
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8楼2011-05-28 18:21:20
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2011-05-28 13:22:27:
你用一个原来转进酵母的质粒作对照转DH5a，就可以知道你的问题是感受态的问题还是酵母提取质粒试剂盒的问题。
你还可以通过PCR来验证你是否提取酵母质粒成功。如果以你提取的酵母质粒PCR都没条带，那么几乎可以肯 ...

那我提出来的酵母质粒不做PCR直接送去测序可以吗？测序公司测序时候不都是也要PCR扩增的吗？之所以这么问是因为我测序一个样才几十块钱，要是做PCR还得买原料还得合成引物，费时又费钱....
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9楼2011-05-28 19:25:36
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
引用回帖:
Originally posted by baby1_9253344 at 2011-05-28 19:25:36:
那我提出来的酵母质粒不做PCR直接送去测序可以吗？测序公司测序时候不都是也要PCR扩增的吗？之所以这么问是因为我测序一个样才几十块钱，要是做PCR还得买原料还得合成引物，费时又费钱....

用通用引物Pcr。 你直接提取的酵母质粒浓度估计太小，没法测序，测序也只能转DH5a后再培养菌液直接测序。
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仕不可不弘毅，任重而道远
10楼2011-05-29 01:13:09
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