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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 酵母质粒转化及提取验证问题求助
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)

[求助] 酵母质粒转化及提取验证问题求助

最近需将穿梭质粒转入啤酒酵母W303内，用化学法（醋酸锂）转化，URA选择性平板培养数日后终于出现阳性菌落。为了鉴定阳性转化子是否转入质粒，我挑了阳性菌落，用酵母质粒抽提试剂盒提取了质粒，用这个质粒转入DH5alfa（50ul感受态细胞，5ul质粒），但平板上没有阳性菌落。随后又重复转DH5alfa（100ul感受态细胞，10ul质粒），仍无阳性转化子。现在不知道该怎么办了，求助各位~
现在问题很多，很乱：
1，转DH5a失败原因可能在转化操作，也可能是质粒的问题。因为之前老外邮寄过来的质粒就是先在DH5a里扩增的，因此前者可排除。所以就是质粒出了问题。
2，质粒的问题有二：要么根本没转进酵母，要么试剂盒没提出质粒。
3，要想验证问题2，是应该做PCR验证还是直接将酵母里提出的质粒测序？
4，酵母质粒抽提时候，摇菌条件对质粒影响大吗？试剂盒说明上说过度培养会使ＤＮＡ降解；坛子里有虫子说要酵母菌液１０ｍｌ，那最后洗脱使用洗脱剂体积多少合适？

先谢过各位了～
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1楼 2011-05-26 15:17:31
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
3楼2011-05-27 10:12:41
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
没有做酵母的虫子吗
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2楼2011-05-26 20:09:54
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deblway

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

baby1_9253344(金币+2): 2011-05-27 15:57:11
额。。感觉上咋跟我理解的不一样呢。。穿梭质粒是在DH5a中扩增的，您的质粒是应该线性化后再转入酵母菌中进行同源重组吧。。。筛选的应该是拷贝数较高的菌株！没太明白如何从酵母菌中提取转染进的线性质粒？可能是我孤陋了。。据我所知是无法从已经转染过后的酵母菌种提取质粒的吧。。。
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海贼王！哥当定了。。。。
4楼2011-05-27 14:57:56
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baby1_9253344

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by deblway at 2011-05-27 14:57:56:
额。。感觉上咋跟我理解的不一样呢。。穿梭质粒是在DH5a中扩增的，您的质粒是应该线性化后再转入酵母菌中进行同源重组吧。。。筛选的应该是拷贝数较高的菌株！没太明白如何从酵母菌中提取转染进的线性质粒？可能是 ...

您的意思是质粒在酵母中线性化就不能再提出来了吗？试剂公司有卖酵母质粒提取试剂盒的，我就是用那个试剂盒提取的...
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5楼2011-05-27 15:58:46
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