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baby1_9253344金虫 (小有名气)
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[求助]
酵母质粒转化及提取验证问题求助
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最近需将穿梭质粒转入啤酒酵母W303内，用化学法（醋酸锂）转化，URA选择性平板培养数日后终于出现阳性菌落。为了鉴定阳性转化子是否转入质粒，我挑了阳性菌落，用酵母质粒抽提试剂盒提取了质粒，用这个质粒转入DH5alfa（50ul感受态细胞，5ul质粒），但平板上没有阳性菌落。随后又重复转DH5alfa（100ul感受态细胞，10ul质粒），仍无阳性转化子。现在不知道该怎么办了，求助各位~ 现在问题很多，很乱： 1，转DH5a失败原因可能在转化操作，也可能是质粒的问题。因为之前老外邮寄过来的质粒就是先在DH5a里扩增的，因此前者可排除。所以就是质粒出了问题。 2，质粒的问题有二：要么根本没转进酵母，要么试剂盒没提出质粒。 3，要想验证问题2，是应该做PCR验证还是直接将酵母里提出的质粒测序？ 4，酵母质粒抽提时候，摇菌条件对质粒影响大吗？试剂盒说明上说过度培养会使ＤＮＡ降解；坛子里有虫子说要酵母菌液１０ｍｌ，那最后洗脱使用洗脱剂体积多少合适？ 先谢过各位了～ |
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